PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

METHODEN
wurden die infizierten Zellkulturen bei –70 °C eingefroren, um durch Lyse der Zellen
intrazelluläres CSFV freizusetzen. Zur Abtrennung der Zelltrümmer von virushaltigem
Überstand wurde das Lysat bei 2000 x g und 4 °C für 30 min zentrifugiert. Die
Virusernte wurde aliquotiert und bei -70 °C gelagert.
6.11.2 Virustitration
Zur Bestimmung der Viruskonzentrationen wurden CSFV-haltige Suspensionen in
Kulturmedium über mehrere Stufen titriert und 100 µl auf Flachbodenmikrotiterplatten
ausgebracht.
STE-Zellen wurden so auf die Platte gesplittet, dass nach 3-tägiger Inkubation (STE-
Medium: 40 % MEM-NEAA, 40 % L-15 10 % TPB 10 % Pferdeserum 100 U/ml
Penecillin G 0,1 mg/ml Streptomycinsulfat,37 °C/5 % CO2) 100 % Konfluenz erreicht
war. Nach Inkubation wurde der Zellrasen gewaschen, getrocknet und für 20 min bei
4 °C mit 100 µl Ethanol pro Vertiefung fixiert. Anschließend wurde die Platte
getrocknet und ein anti-E2 monoklonaler Antikörper (mAk a18; 1:40 in PBS)
dazugegeben. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 °C wurde die Platte dreimal
gewaschen und ein Peroxidase-konjugierter Ziege-anti-Maus-Antikörper (1:1000 in
PBS) zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 37 °C wurde die
Platte fünfmal gewaschen und AEC Substratlösung mit 0,1 µl/ml H2O2
(50 µl/Vertiefung) zugegeben. Nach ca. 15-20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln
wurde der Zellrasen einmal gewaschen und der Virustiter durch Auszählen der
gefärbten Plaques im Mikroskop bestimmt.
6.11.3 Virusnachweis aus Blut, Organen und Nasentupfern
Für den Virusnachweis wurden die Proben wie folgt vorbereitet.
● Blut: 1 ml Vollblut wurde mit 1 ml Lysepuffer (8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 0,372 g
EDTA ad 1L pH 7,3) versetzt und bei 4 °C gelagert. Diese Lösung wurde
anschließend für eine Virustitration eingesetzt.
● Nasentupfer: Die Nasentupfer wurden in 1ml PBS resuspendiert, sterilfiltriert und
anschließend für die Virustitration eingesetzt.
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