PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

METHODEN
Durch Zugabe von 10 mM EGTA und Inkubation bei 75°C (15 min) wurde die CIP
inaktiviert und durch anschließende Phenol/Chloroform-Extraktion aus der Lösung
entfernt.
6.4.8 Ligation von DNA
Für die Ligation von Vektor- und Insert-DNA wurde die T4-DNA-Ligase verwendet.
Eingesetzt wurden jeweils ca. 200 ng Vektor-DNA und ein äquimolares Verhältnis an
Insert-DNA. Die Ligation erfolgte mit 200 U T4-DNA-Ligase in 1x T4-DNA-Ligase-
Puffer und einem Gesamtvolumen von 20 µl. Bei glatten Enden der DNA-Moleküle
(„blunt/blunt“-Ligation) wurde der Reaktionsansatz über Nacht bei 14°C inkubiert, bei
Ligation von kohäsiven Enden („sticky/sticky“) wurde die Reaktion 2 Stunden bei
Raumtemperatur oder 6 Stunden bei 16°C durchgeführt.
6.4.9 Amplifikation von DNA-Fragmenten über PCR
Die Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) wurden in Thermocyclern mit beheizbaren
Deckel besitzen. Ein Überschichten der Reaktionsansätze mit Mineralöl war aus
diesem Grund nicht nötig.
6.4.9.1 Präparative PCR-Ansätze:
Amplifizierte DNA-Fragmente, die nachfolgend für Klonierungen in Plasmid-
Vektoren eingesetzt wurden, wurden mittels des Expand TM High Fidelity PCR
Systems (Roche) hergestellt. Der in diesem System eingesetzte Enzymmix aus einer
Taq und einer Pfu DNA-Polymerase resultiert in einer extrem niedrigen Fehlerrate der
amplifizierten Sequenz. Reaktionsansätze, -bedingungen und PCR-Zyklen wurden
nach den Angaben des Herstellers gewählt. Die Annealing-Temperatur (Ta) für die
Hybridisierung der Primer an die Matrizen-DNA wurde in Abhängigkeit des GC-
Gehaltes der Primersequenz entsprechend der „4+2“-Regel (Ta= Tm-2°C; Tm=4°C
(G+C) + 2°C (A+T)) bestimmt. Nach Reaktionsende wurde 1/10 des PCR-Ansatzes
gelelektrophoretisch analysiert, für Klonierungen gewünschte Fragmente wurden aus
präparativen Agarosegelen isoliert und gereinigt
6.4.9.2 Analytische PCR-Ansätze:
Für die Analyse isolierter Gene hinsichtlich der Größe des Zielgens wurden PCRs mit
„Ready-to go“ PCR Beads (Amersham Pharmacia) durchgeführt. Diese lyophylisierten
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