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ERGEBNISSE Vor Insertion der zweiten Transkriptionseinheit (IL-12, IL-18, CD40L) musste in den pRC/RSV-E2-Vektor eine zusätzliche Hpa I-Schnittstelle eingeführt werden. Dazu wurde das Plasmid mit Sma I und Bstb I verdaut und ein Oligonukleotidlinker (pRSV.seq/rev) inseriert. Das Plasmid wurde anschließend Hpa I verdaut und der Vektor dephosphoryliert.Zur Einführung der zweiten Transkriptionseinheit (IL-12, IL- 18, CD40L) in den pcDNA4HisMax-E2-Vektor wurde ein Pml I-Verdau durchgeführt und der Vektor zur Verhinderung einer Religation ebenfalls dephosphoryliert (Abb. 3- 5). Abb. 3-5: Vorbereitung der E2-Vakzin-Vektoren auf die Insertion der zweiten Transkriptionseinheit (IL-12, IL-18, CD40L). Mittels eines Oligonukleotidlinkers (pRSV.seq/rev) wurde eine Hpa I Schnittstelle über Sma I und Bstb I in den pRC/RSV-E2- Vektor eingeführt, Hpa I verdaut und der Vektor dephosphoryliert. Im Gegensatz dazu wurde der pcDNA4HisMax-E2-Vektor ausschließlich Pml I verdaut und danach dephosphoryliert. 22
ERGEBNISSE Zur Entnahme der kompletten Transkriptionseinheit (Promotor + Cytokin oder immunstimulatorisches Molekül) wurden die konstruierten pcDNA3-IL-18-/IL-12- /CD40L-Vektoren mit Nru I verdaut und das isolierte Fragment (Transkriptions- einheiten) anschließend in die entsprechend vorbereiteten E2-Vakzine-Vektoren inseriert. Die Transkriptionskassetten wurden für das pcDNA4HisMax-E2-Plasmid blunt in die Pml I- und für die pRC/RSV-E2-Plasmide blunt in die Hpa I- Schnittstelle eingesetzt. Nachfolgend wurde die Spezifität der Sequenzen durch Sequenzanalyse überprüft und die Plasmide großmaßstäblich aufgereinigt (Abb. 3-6). 23
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ERGEBNISSE Abb. 3-36: Analyse resis
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ERGEBNISSE Abb. 3-37: Analyse der I
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1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
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ERGEBNISSE Abb. 3-40: E2-Expression
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DISKUSSION E2-Poxvirus [Hahn, 2001]
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DISKUSSION Der Nachweis der sekreti
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DISKUSSION Testsystemen nach erfolg
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DISKUSSION Versuchsansätzen wurde
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DISKUSSION Zell-Depletion zu verzei
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DISKUSSION p35-Untereinheit zeigte
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5 MATERIAL MATERIAL 5.1 Bakterienst
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● Linker MATERIAL SmaI SV40 Hpa I
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MATERIAL Ziege-anti-Kanninchen IgG,
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5.8 Radioaktive Substanzen MATERIAL
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5.10.1 Zentrifugen MATERIAL Biofuge
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Transfektionsmethoden METHODEN •
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METHODEN 12000 rpm). Nach den Extra
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METHODEN Reaktions“kugeln“ enth
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METHODEN peratur inkubiert. Nach Zu
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METHODEN konstante Geltemperatur vo
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METHODEN 6.5.2 RNA-Agarosegelelektr
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METHODEN 6.6.2 Diskontinuierliche S
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METHODEN Nitrozellulosemembran in 3
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METHODEN induzierbare Expression de
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METHODEN Reinheit und ihren Protein
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METHODEN ● Organe: Je 500 mg eine
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METHODEN 6.12.2.3 Nachweis der IL-1
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METHODEN stellt ein relatives Maß
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ANHANG 610 630 650 TCGGAGAGAATCTTAC
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LITERATUR Birnboim, H.C., Doly, J.
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LITERATUR D´Andreas, A., Rengaraju
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LITERATUR Makoff, A.J., Oxer, M.D.,
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LITERATUR Nobiron, I., Thompson, I.
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LITERATUR Ruiz, P.J., Garren, H., R
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LITERATUR Sypek, J.P., Chung, C.L.,
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LITERATUR Wei, W.Z., Shi, W.P., Gal
Seite 169:
Persönliche Daten Name: Daniel Wie
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