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METHODEN
6.5.2 RNA-Agarosegelelektrophorese [KROCZEK, 1990]
Einzelsträngige RNA-Moleküle bilden im nativen Zustand Sekundärstrukturen aus, die
das Laufverhalten der RNA während der Elektrophorese beeinträchtigen. Daher erfolgt
zum einen die Vorbereitung der Proben für den Gelauftrag wie auch die
elektrophoretische Auftrennung der RNA unter denaturienden Bedingungen. Für die
Denaturierung der RNA vor der Elektrophorese wurde die RNA mit einem
Formaldehyd/Formamid-haltigen Probenpuffer im Verhältnis 5:1 gemischt, 15 min bei
65°C erhitzt und auf Eis abgeschreckt. Die anschließende Auftrennung der RNA
erfolgte in 1,3%igen, formaldehydhaltigen Agarosegelen. Hierzu wurden 1,3 g
Agarose in 80 ml DEPC-behandeltem H2O aufgekocht. Nach Abkühlen der Agarose
auf etwa 60°C wurden 10 ml 10x MOPS/EDTA und 3 ml Formaldehyd zugegeben.
Nach einem 30minütigen Vorlauf bei 50 V wurden die Proben aufgetragen und bei 80
V über 3-4 Stunden aufgetrennt. Als Laufpuffer diente 1x MOPS/EDTA.
10x MOPS/EDTA: 0,2 M MOPS, 10 mM Natriumacetat, 10 mM EDTA pH
7,0 (eingestellt mit Eisessig)
RNA-Probenpuffer: 200 µl 10x MOPS/EDTA, 1 ml Formamid (deionisiert),
345 µl Formaldehyd (37%), 5 µl Ethidiumbromid
(10 mg/ml), 100 µl Formamid-Dye
Formamid-Dye: 0,1% Bromphenolblau, 0,1% Xylenxyanol, 10 mM EDTA
6.5.3 In vitro Transkription
Die Herstellung der T7-Transkripte für in vitro Transkriptionsanalyse erfolgte über in
vitro Transkriptionsreaktionen mit T7 RNA-Polymerasen (Roche). Die zu
transkribierende Plasmid-DNA („Transkriptions-Matrize“) wurde zuvor mit einem
entsprechenden Restriktionsenzym linearisiert, bei Bedarf mit Mung Bean Nuklease
behandelt, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die
Vollständigkeit der Linearisierung wurde in der Gelelektrophorese überprüft.
Reaktionsansatz: 1 µg DNA
2 µl 10x Transkriptionspuffer (Roche)
2 µl 10 mM rNTPs
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