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ERGEBNISSE Abb. 3-2: RT-PCR für die cDNA des porcinen IL-18. Je 1/10 des PCR Ansatzes wurden auf das 1%ige, Ethidiumbromid-gefärbte Agarosegel aufgetragen. Das IL-18 spezifische Signal (1) ist durch einen Pfeil gekennzeichnet und besitzt eine Größe von ca. 580 bp. In Spur 2 ist die Wasserkontrolle dargestellt. Der Längenmarker ist partiell am linken Bildrand in kb angegeben. 3.1.2.2 Isolation der cDNA für den porcinen CD40L Für die Herstellung der cDNA des porcinen CD40L wurden zunächst PBMC in Kultur genommen und mit ConA (5µg/ml) stimuliert. Nach 24stündiger Inkubation wurde die Gesamtzell-RNA isoliert. Da die cDNA-Sequenz des porcinen CD40L bis dato nicht bekannt war, mussten degenerierte Primer auf Basis von Sequenzvergleichen der CD40L-cDNA-Sequenzen von Maus (Nr. X654538), Mensch (Nr. L07414) und Rind (Nr. Z48469) erstellt werden. Mit diesen Primern (CD40L-iso.seq/rev) gelang es durch reverse Transkription und anschließende PCR ein spezifisches Produkt von 786 bp Länge zu isolieren, welches für ein 29 kDa großes Protein kodiert (Abb. 3-3). Nach Klonierung der PCR-Fragmente erfolgte die Sequenzanalyse. Um mögliche Nukleotid- austausche, die auf Fehler der reversen Transkriptase oder High Fidelity-Taq- Polymerase zurückzuführen sind, zu ermitteln, wurde das porcine CD40L-Fragment mehrmals unabhängig voneinander amplifiziert, kloniert und sequenziert. Der Vergleich der Aminosäuresequenz mit bereits publizierten CD40L-Sequenzen anderer Spezies ergab eine 88 %ige, 89 %ige bzw. 93 %ige Übereinstimmung mit humanem, felinem bzw. bovinem CD40L (siehe Anhang). 18
ERGEBNISSE Abb. 3-3: RT-PCR für die cDNA des porcinen CD40L. Je 1/10 des PCR-Ansatzes wurden auf das 1%ige, Ethidiumbromid-gefärbte Agarosegel aufgetragen. Das CD40L-spezifische Signal (1) ist durch einen Pfeil gekennzeichnet und besitzt eine Größe von ca. 780 bp. In Spur 2 ist die Wasserkontrolle dargestellt. Der Längenmarker ist partiell am linken Bildrand in kb angegeben. 3.1.2.3 Konstruktion der E2-IL-18-/ IL-12-/ CD40L-Vakzine-Vektoren Für die Konstruktion der E2-IL-18-/ IL-12-/ CD40L-Vakzine-Vektoren war es notwendig, Vektoren mit zwei unabhängigen Transkriptionseinheiten zu erstellen, da die verwendeten Zytokine bzw. immunstimulatorischen Moleküle zum einen sekretorisch (IL-18, IL-12), zum anderen aber auch als Oberflächenproteine (CD40L) exprimiert wurden. Abgesehen von möglichen konformationellen Problemen bei der Proteinfaltung würde z.B. ein E2-Cytokin-Fusionsprotein keine gleichzeitige sekretorische Expression des Cytokins und intrazelluläre Expression des E2- Glykoproteins ermöglichen. Im Sonderfall des IL-12-E2-Vakzin-Vektors mussten zwei unabhängige Transkriptionseinheiten verwendet werden, von denen eine zusätzlich eine polycistronische Transkriptionseinheit war, die die gleichzeitig gekoppelte Expression der heterodimeren Moleküle des IL-12 ermöglichte. Zur Vereinfachung der Klonierungsstrategie sollten die isolierten cDNA-Fragmente der Zytokine in einem Zwischenklonierungsschritt in einen eukaryontischen Expressionsvektor kloniert und anschließend als Transkriptionseinheit in die 19
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ERGEBNISSE Aufgrund der geringen Au
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ERGEBNISSE CD40L (Abb. 3-35 A) spez
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1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
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ERGEBNISSE Abb. 3-40: E2-Expression
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DISKUSSION E2-Poxvirus [Hahn, 2001]
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DISKUSSION Der Nachweis der sekreti
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DISKUSSION Testsystemen nach erfolg
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DISKUSSION Versuchsansätzen wurde
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DISKUSSION Zell-Depletion zu verzei
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DISKUSSION p35-Untereinheit zeigte
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5 MATERIAL MATERIAL 5.1 Bakterienst
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● Linker MATERIAL SmaI SV40 Hpa I
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MATERIAL Ziege-anti-Kanninchen IgG,
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5.8 Radioaktive Substanzen MATERIAL
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5.10.1 Zentrifugen MATERIAL Biofuge
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6.1.3 Transformation METHODEN Für
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Transfektionsmethoden METHODEN •
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METHODEN 12000 rpm). Nach den Extra
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METHODEN 6.4.5 Abdau überhängende
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METHODEN Reaktions“kugeln“ enth
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METHODEN peratur inkubiert. Nach Zu
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METHODEN konstante Geltemperatur vo
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METHODEN 6.5.2 RNA-Agarosegelelektr
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METHODEN 6.6.2 Diskontinuierliche S
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METHODEN Nitrozellulosemembran in 3
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METHODEN induzierbare Expression de
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METHODEN Reinheit und ihren Protein
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METHODEN ● Organe: Je 500 mg eine
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METHODEN stellt ein relatives Maß
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ANHANG 610 630 650 TCGGAGAGAATCTTAC
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Persönliche Daten Name: Daniel Wie
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