PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

METHODEN
sterile Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt. Die SDS-Konzentration wurde auf 2%,
die DTT-Konzentration auf 10 mM eingestellt. Die Proben wurden 3x für 15 s
beschallt und schließlich für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend
wurden die Lysate für 10 min auf 95°C erhitzt und auf Eis abgekühlt.
6.6.7.3 Radioimmunpräzipitation
Für die Präzipitation wurden zu je 50 µl Zelllysat 5 µl polyklonales Serum zugegeben,
mit IPB auf 100 µl aufgefüllt und über Nacht bei 4°C getaumelt. Für die Präzipitation
der Antigen/Antikörper-Komplexe wurden pro Ansatz 10 mg Protein A Sepharose in
H2O gequollen (1 h, 37°C), mehrmals mit IPB gewaschen, in 300 µl IPB
aufgenommen und anschließend zum Präzipitationsansatz zugegeben. Die Suspension
wurde erneut über Nacht bei 4°C oder für 4 h bei Raumtemperatur (RT) getaumelt.
Das Sepharose-Präzipitat wurde schließlich abzentrifugiert (14000 rpm, 10 min, RT),
2x mit je 500 µl 0,5xNDET/0,3% SDS gewaschen, in 25 µl H2O und 25 µl 4x SDS-
Probenpuffer aufgenommen und für 10 min auf 95°C erhitzt. Nach Zentrifugation
(14000 rpm, 10 min) wurde der Überstand mit den gelösten Proteinen in ein neues
Reaktionsgefäß überführt und erneut für 10 min bei 95°C denaturiert. Anschließend
wurden 20 µl eines Ansatzes in einer SDS-PAGE analysiert. Das Gel wurde für die
autoradiographische Detektion der aufgetrennten [ 35 S]-markierten Proteine für je 30
min in Fixierer und En 3 Hance geschwenkt, gewässert, getrocknet und auf einem
Röntgenfilm exponiert.
IPB: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1% Triton X-
100
0,5xNDET 0,5% Nonidet P40, 0,2% Natriumdesoxycholsäure,
33 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)
6.7 Bakterielle Expression viraler und porciner Proteine
Zur Expression wurden die rekombinanten pQE-51- oder pGEX-Vektoren in E.coli
M15 transformiert. Das in diesem Stamm in mehreren Kopien vorhandene Plasmid
pREP4 trägt eine Kanamycinresistenz und das für den lac-Repressor kodierende lacI-
Gen. Die Möglichkeit den lac-Repressor durch IPTG zu inaktivieren gestattet eine
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