PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

6.12.3.4 Serumneutralisationstest
METHODEN
Für die Bestimmung der Titer, der im Serum enthaltenen neutralisierenden Antikörper
wurde das Serum in log-2 Stufen in Flachbodenmikrotiterplatte verdünnt (je 50 µl)und
je 100 KID50/ 50 µl CSFV (Stamm Alfort) zugegeben. Nach 1 stündiger Inkubation bei
37 °C wurde 100 µl einer STE-Zellsuspension zugegeben, so dass nach 3 Tagen eine
Konfluenz von 100 % erreicht war. Als Kontrollen wurden STE-Zellen ohne Virus
bzw. ein Serum mit bekanntem Titer mitgeführt und der Titer des eingesetzten Virus
bestimmt.
Die nach 3 Tagen durchgeführte Fixierung und Färbung der Reaktion wurde analog zu
6.11.2 durchgeführt.
6.12.4 Immunfluoreszenzanalyse
6.12.4.1 Oberflächenfluoreszenzanalyse
Zur Oberflächenfluoreszenzanalyse wurden die Zellen mit PBS gewaschen und
anschließend für 5 min mit 100 % ETOH fixiert. Nach 3maligem Waschen wurden die
Zellen mit einem monoclonalen Ab versetzt und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen erneut 3 mal mit PBS gewaschen und mit einem
fluorescein-isothiocyanate (FITC)-konjugierten Zweitantikörper versetzt. Nach 1
stündiger Inkubation wurden die Zellen 3 mal mit PBS gewaschen und mit DABCO-
Fluoreszenzerhaltungspuffer überschichtet.
Die Fluoreszenz der Zellen wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop analysiert
6.12.4.2 Cytoplasmatische Fluoreszenzanalyse
Für die Analyse der cytoplasmatischen Expression wurden die Zellen mit PBS
gewaschen und anschließend für 20 min mit 3 % Paraformaldehyd mit 0,2 % Triton-X
fixiert. Alle weiteren Schritte erfolgten analog zu 6.13.5.1.
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