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ERGEBNISSE
mehrerer anderer Zellfraktionen zustande kommt. Daher wurde für jede Analyse
zusätzlich die absolute Zellzahl ermittelt und daraus die absolute Anzahl der B-Zellen
bestimmt. Diese Daten bestätigten die vorherigen Beobachtungen (Daten nicht
gezeigt) und machen deutlich, dass beim Vergleich mit allen anderen Konstrukten eine
Immunisierung mit dem pcDNA4HisMax-E2-IL-18-bzw. pcDNA4HisMax-CD40L-
Konstrukt nicht nur eine B-Zell-Depletion unterdrückt, sondern außerdem in einigen
Fällen eine Stimulation der B-Zell-Proliferation bewirkt
3.4 Darstellung von porcinem IL-12, IL-18 und dem CD40L im pro-
und eukaryontischen System
Ein weiterer wichtiger Aspekt dieser Arbeit bestand in der Expression und
Charakterisierung der Zytokine und immunstimulatorischen Moleküle. Dabei wurden
zwei grundlegende Strategien verfolgt. Zum einen sollten durch prokaryontische
Systeme die Proteine in großen Mengen exprimiert und gereinigt werden, um
anschließend, so weit noch nicht vorhanden, spezifische Antiseren herzustellen.
Zum anderen sollten Zytokine und immunstimulatorische Moleküle im
eukaryontischen System als aktive Moleküle exprimiert werden, da die fehlenden
Glykosylierungen und mögliche konformationelle Unterschiede im prokaryontischen
Expressionssystem unter Umständen einen Verlust dieser biologischen Aktivität nach
sich ziehen könnten.
Zur Darstellung der Proteine wurde die cDNA von CD40L, IL-12 und IL-18 in
prokaryontische und eukaryontische Vektoren kloniert und die Expression anhand von
SDS-PAGE und Western Blot sowie gegebenenfalls durch Radioimmunpräzipitation
oder funktionelle Assays analysiert.
3.4.1 Prokaryontische Expression und Reinigung des porcinen CD40L
Für die Expression des porcinen CD40L-Gens wurde das pQE-E.coli-
Expressionssystem ausgewählt, da es bereits mehrfach mit großem Erfolg eingesetzt
wurde [Oem, 2000] und die Möglichkeit einer induzierbaren Expression bietet.
Da sich, ausgehend von früheren Erfahrungen, eine Expression membranständiger
Moleküle aufgrund der Signal-Anker-Sequenz in prokaryontischen Systemen als
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