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DISKUSSION
porcinen Sequenz und bereits veröffentlichten Sequenzen anderer Spezies zeigten eine
Übereinstimmung von 93%, 89%, 86%, bzw. 88% mit bovinem, felinem, caninem
bzw. humanem CD40L (siehe 7.2). Wie für den humanen und murinen CD40L
beschrieben, enthält der porcine CD40L eine 13 AS lange terminale Sequenz gefolgt
von einer 32 AS langen hydrophoben Signal-Anker-Sequenz, welche für ein Typ-II-
Membranprotein mit extrazellularem Caboxyterminus charakteristisch ist. [Armitage,
1992; Noelle, 1992]. Im Gegensatz zur humanen CD40L-Sequenz, die zwei potentielle
N-Glykosylierungsstellen enthält [Armitage,1992], konnte in der Sequenz des
porcinen CD40L nur eine potentielle N-Glykosylierungstelle identifiziert werden.
Für beide E2-Vektortypen (pcDNA4HisMax-E2, pRC/RSV-E2) wurden somit
Konstrukte hergestellt, die zusätzlich die cDNA eines der immunstimulatorischen
Moleküle enthielten. Dabei konnten in die Konstrukte zwei voneinander unabhängige
Transkriptionseinheiten inseriert werden, wodurch unterschiedliche Expressionsarten
der einzelnen Sequenzen ermöglicht wurden (intrazelluläre- und sekretorische
Expression pcDNA4HisMax-E2-IL-12/-IL-18 bzw. intrazelluläre- und membran-
assoziierte Expression, pcDNA4HisMax-E2-CD40L). Nach Etablierung eines
Testsystems zur Überprüfung der in vitro Transkription der Plasmide konnten für alle
Konstrukte spezifische Transkriptionsprodukte nachgewiesen werden.
Voraussetzung für eine erfolgreiche Immunisierung ist die Expression eines möglichst
authentischen Genproduktes. Daher erfolgte die Analyse der zellulären Expression des
E2-Glykoproteins für alle Plasmide durch Immunfluoreszenz nach transienter
Transfektion von MAX-Zellen, wobei wie bei virus-infizierten Zellen große Mengen
des Proteins nachgewiesen werden konnten [Weiland, 1990]. In vitro zeigten sich
keine signifikanten Unterschiede in der exprimierten E2-Menge zwischen Plasmiden
mit RSV- bzw. CMV-Promotoren.
Der Nachweis der Expression für die immunstimulatorischen Moleküle wurde für den
CD40L durch Oberflächenfluoreszenzanalyse nach transienter Transfektion von
MAX-Zellen erbracht, wobei gezeigt werden konnte, dass der CD40L als Oberflächen-
molekül exprimiert wird und somit für eine Interaktion mit immunregulatorischen
Zellen zugänglich ist.
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