PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

METHODEN
2x Farbmarker 95% Formamid, 50 mM Tris-HCl, pH 8,3,
50 mM Borsäure, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenolblau,
0,05% Xylencyanol in H2O
6.4.13 Denaturierende Harnstoff-Polyacrylamidgele:
Je nach Größe der aufzutrennenden Oligonukleotide wurden 8-20%ige denaturierende
Gele verwendet. Hierzu wurde eine 29:1 Acrylamid-Stammlösung (30%) in 0,5x TBE-
Puffer entsprechend verdünnt und mit 7 M Harnstoff versetzt. Für die Polymerisation
wurden 1/5000 Vol. TEMED und 1/100 Vol. APS (10%) zugesetzt.
29:1 Acrylamid-Lösung: 29% (w/v) Acrylamid, 1% (w/v) N,N´-Methylenbis-
acrylamid in H2O
5x TBE: 450 mM Tris, pH 8,3, 450 mM Borsäure,
10 mM EDTA in H2O
6.5 Präparation und Analyse von RNA
Für Arbeiten mit RNA wurden fabrikverpackte Chemikalien und Verbrauchs-
materialien benutzt. Zur Inaktivierung möglicher RNasen wurden Elektrophorese-
kammern mit H2O2 oder aktivem DEPC/DMPC-H2O behandelt, Glaswaren und
Eppendorfreaktionsgefäße wurden für 3 Tage bei 100°C gebacken. H2O und
Lösungen, die keine Amine enthielten, wurden mit 0,1% DEPC oder 0,1% DMPC
versetzt und über Nacht gerührt. Das DEPC/DMPC wurde anschließend durch
Autoklavieren inaktiviert.
6.5.1 Isolierung von RNA aus Eukaryoten-Zellen
Die Präparation von Gesamtzell-RNA aus eukaryotischen Zellen erfolgte mittels des
peqGold TriFast-Reagenz (Peqlab) oder des RNeasy Kits (Qiagen) jeweils nach
Angaben der Hersteller.
116