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METHODEN
6.6.2 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgte durch eine diskontinuierliche
SDS-PAGE nach LAEMMLI (1970). Soweit im Text nicht anders vermerkt wurden
Trenngele mit einer Konzentration von 12,5% Acrylamid und Sammelgele mit 5%
Acrylamid verwendet. Vor dem Auftrag wurden die Proben mit 0,25 Volumen 4x
SDS-Probenpuffer versetzt und durch 10minütiges Erhitzen auf 95°C denaturiert. Die
Elektrophorese erfolgte in Tris-Glycin-Puffer bei einer konstanten Stromstärke von
25 mA in einer Minigelapparatur.
Sammelgel Trenngel
Acrylamid 5% 12,5%
30% Acrylamid 1,67 ml 12,5 ml
1% N,N‘-Methylenbisacrylamid 1,30 ml 3,1 ml
1 M Tris-HCl, pH 8,8 - 11,2 ml
1M Tris-HCl, pH 6,8 1,25 ml -
20% SDS 0,05 ml 0,15 ml
ad H2O 10 ml 30 ml
TEMED 5 µl 10-20 µl
10% Ammoniumpersulfat (APS) 50 µl 400 µl
4x SDS-Probenpuffer: 8% SDS, 20% ß-Mercaptoethanol, 20% Glycerin,
0,004% Bromphenolblau, 250 mM Tris-HCl, pH 6,8
Tris-Glycin-Puffer: 192 mM Glycin, 25 mM Tris-OH, 0,1% SDS
6.6.3 Coomassie-Färbung von Proteinen
Die durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteine wurden durch Färben mit Coomassie
Brillant Blue sichtbar. Hierfür wurde das Gel 1 h in Coomassie-Färbelösung
geschwenkt und anschließend in Fixierlösung so lange entfärbt, bis der Hintergrund
klar und die Proteinbanden deutlich sichtbar waren.
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