PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

METHODEN
PBS: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,12 g Na2PO4, 0,2 g KH2PO4
0,1 g CaCl2, 0,1 g MgCl2 x 6 H2O, ad 1l H2O bidest
6.2.1.2 Isolierung von PBMC
Zur Gewinung mononukleärer Zellen aus dem peripheren Blut (peripheral blood
mononuclear cells, PBMC) wurde heparinisiertes Blut im Verhältnis 1:1 mit PBS
verdünnt. Davon wurden je 30 ml auf 15 ml Ficoll-Paque (Dichte 1,077 g/ml)
geschichtet (Boyum, 1964). Nach Zentrifugation (30 min, 800 x g, RT) konnten die
PBMC aus der Interphase zwischen Serum und Ficoll entnommen werden. Die PBMC
wurden zweimal mit PBS und einmal mit Lymphozytenkulturmedium gewaschen
(10 min, 500 x g, 4 °C).
6.2.1.3 Bestimmung der Anzahl vitaler Zellen
Zur Bestimmung der Anzahl lebender Zellen wurden 10 µl einer Zellsuspension mit
90 µl Trypanblau-Lösung (0,2% in 0,15 NaCl) verdünnt. Ungefärbte lebende Zellen
wurden in einer Neubauer-Zählkammer unter dem Mikroskop ausgezählt. Die Zellzahl
pro ml Zellsuspension ergab sich aus der Zellzahl in 4 Eckquadraten (Z), dem
Kammerfaktor (KF=10 4 ) und dem Verdünnungsfaktor (V; hier: 10) wie folgt:
T (Zellen/ml) = KF x Z x V
6.2.1.4 Transfektion eukaryotischer Zellen
Bestimmung der Transfektionseffizienz
Zur Bestimmung der Transfizierbarkeit verschiedener Zelllinien oder um die
Transfektionseffizienz einzelner Methoden zu prüfen wurden Zellen mit dem EGFP-
Expressionsplasmid pEGFP-N3 transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion wurde das
Medium abgenommen und die Zellen ohne weitere Fixierung unter einem
Fluoreszenzmikroskop analysiert. Das Verhältnis von fluoreszierenden zu nicht
fluoreszierenden Zellen und damit die Transfektionseffizienz wurde optisch
abgeschätzt.
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