PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

ERGEBNISSE
Aufgrund der geringen Ausbeuten bei Expression und Reinigung und dem
Vorhandensein eines kommerziell erhältlichen polyklonalen IL-12-Antiserums
(ENDOGEN) wurde auf weitere Aufreinigungschritte zur Gewinnung von p35
verzichtet.
3.4.3 Prokaryontische Expression und Reinigung von porcinem IL-18
Ausgehend von den guten Ergebnissen, die bei der Expression des porcinen CD40L
mit dem pQE-System erzielt wurden, sollte dieses auch für die Expression des
porcinen IL-18 verwendet werden. Für die Herstellung des IL-18-
Expressionskonstruktes wurde die cDNA des porcinen IL-18 mittels der Primer IL-
18bak-seq/rev aus dem pcDNA4HisMax-E2-IL-18-Plasmid amplifiziert.
Die dadurch eingeführten Schnittstellen für BamH I/Pst I sowie ein carboxyterminales
Hexahistidin-Ende wurden für die Klonierung in das pQE-51-Plasmid und spätere
Reinigung des exprimierten Proteins verwendet (Abb. 3-32).
Abb. 3-32: Klonierungsstrategie für das pQE-IL-18-Expressionsplasmid. Die porcine IL-18-
Sequenz wurde mit den Primern IL-18-bak.seq/rev mittels PCR aus dem pcDNA4HisMax-
E2-IL-18-Plasmid amplifiziert, anschließend mit BamH I/Pst I verdaut und in den analog
behandelten pQE-51-Vektor kloniert. Die für die Klonierung nötigen Schnittstellen sowie ein
carboxyterminales Hexahistidin-Ende wurden bei der Amplifikation über die Primer (IL-18bak.seq/rev)
in das PCR-Fragment eingeführt.
Nach Abschluß der Klonierungsarbeiten wurde das Plasmid in E.coli transformiert und
die Expression nach Induktion mit 0,8 mM IPTG in Coomassie-gefärbten PAA-Gelen
analysiert. Auch hier konnte beim Vergleich von induzierten und nicht induzierten
Kulturen eine deutliche Expression des porcinen IL-18 nachgewiesen werden (Abb. 3-
33 A). Da bei der nativen Aufreinigung des porcinen IL-18 eine hohe Ausbeute erzielt
werden konnte, wurde auf eine denaturierende Aufreinigung verzichtet (Abb. 3-33 B).
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