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ERGEBNISSE
3.4.2.2 Expression der p35 Untereinheit des IL-12
Die Versuche, die p35-Untereinheit mittels pQE-51- und 60-Vektoren zu exprimieren,
erbrachten keine zufriedenstellenden Expressionsdaten. Die Analyse der 2-
dimensionalen Struktur des Moleküls zeigte jedoch keinerlei signifikant hydrophobe
Bereiche im C- bzw. N-terminalen Teil des Proteins, so dass in Anlehnung an Arbeiten
von Pompeia [1997] und Mills [1992] versucht wurde, die p35-Untereinheit als GST-
Fusionsprotein zu exprimieren.
Zu diesem Zweck wurde die p35-cDNA mit Hilfe der spezifischen Primer p35-
bak.seq/rev durch PCR aus dem pcDNA4HisMax-E2-IL-12-Plasmid amplifiziert und
über die eingeführten Schnittstellen nach Verdau mit Sma I/Mun I in den pGEX-2T–
Vektor ligiert. Dabei konnte die über die Primer eingeführte Mun I-Schnittstelle auf
EcoR I gesetzt werden. Zusätzlich erfolgte über den reversen Primer die Insertion
eines carboxyterminalen Hexahistidin-Endes welches eine weitere Reinigungsoption,
ergäbe falls eine Isolation des GST-Fusionsproteins über Glutathione-Sepharose nicht
möglich wäre (Abb. 3-30).
Abb. 3-30: Klonierungstrategie für das pGEX-p35-Expressionsplasmid. Zur Herstellung des
p35-Expressionsplasmides wurde die p35-Sequenz mit den Primern p35-bak.seq/rev mittels
PCR aus dem pcDNA4HisMax-E2-IL-18-Plasmid amplifiziert, anschließend mit Sma I/Mun I
verdaut und über Sma I/EcoR I (Mun I auf EcoR I gesetzt) in den pGEX-2T-Vektor
subkloniert. Die für die Klonierung nötigen Schnittstellen sowie ein carboxyterminales
Hexahistidin-Ende wurden bei der Amplifikation über die Primer (p35-bak.seq/rev) in das
PCR-Fragment eingeführt.
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