PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

ERGEBNISSE
Abb. 3-2: RT-PCR für die cDNA des porcinen IL-18. Je 1/10 des PCR Ansatzes wurden auf
das 1%ige, Ethidiumbromid-gefärbte Agarosegel aufgetragen. Das IL-18 spezifische Signal
(1) ist durch einen Pfeil gekennzeichnet und besitzt eine Größe von ca. 580 bp. In Spur 2 ist
die Wasserkontrolle dargestellt. Der Längenmarker ist partiell am linken Bildrand in kb
angegeben.
3.1.2.2 Isolation der cDNA für den porcinen CD40L
Für die Herstellung der cDNA des porcinen CD40L wurden zunächst PBMC in Kultur
genommen und mit ConA (5µg/ml) stimuliert. Nach 24stündiger Inkubation wurde die
Gesamtzell-RNA isoliert. Da die cDNA-Sequenz des porcinen CD40L bis dato nicht
bekannt war, mussten degenerierte Primer auf Basis von Sequenzvergleichen der
CD40L-cDNA-Sequenzen von Maus (Nr. X654538), Mensch (Nr. L07414) und Rind
(Nr. Z48469) erstellt werden. Mit diesen Primern (CD40L-iso.seq/rev) gelang es durch
reverse Transkription und anschließende PCR ein spezifisches Produkt von 786 bp
Länge zu isolieren, welches für ein 29 kDa großes Protein kodiert (Abb. 3-3). Nach
Klonierung der PCR-Fragmente erfolgte die Sequenzanalyse. Um mögliche Nukleotid-
austausche, die auf Fehler der reversen Transkriptase oder High Fidelity-Taq-
Polymerase zurückzuführen sind, zu ermitteln, wurde das porcine CD40L-Fragment
mehrmals unabhängig voneinander amplifiziert, kloniert und sequenziert. Der
Vergleich der Aminosäuresequenz mit bereits publizierten CD40L-Sequenzen anderer
Spezies ergab eine 88 %ige, 89 %ige bzw. 93 %ige Übereinstimmung mit humanem,
felinem bzw. bovinem CD40L (siehe Anhang).
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