PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

ERGEBNISSE
Nach Abschluß der Konstruktionsarbeiten waren folgende Plasmide vorhanden (Tab.
3-1)
Bezeichnung Enthaltene Sequenzen Promotoren
pcDNA4HisMax keine CMV
pcDNA4HisMax-E2 E2 CMV
pcDNA4HisMax-E2-IL-12 E2, IL-12 CMV, CMV
pcDNA4HisMax-E2-IL-18 E2, il18 CMV, CMV
pcDNA4HisMax-E2-CD40L E2, CD40L CMV, CMV
pRC/RSV keine RSV
pRC/RSV-E2 E2 RSV
pRC/RSV-E2-IL-12 E2, IL-12 RSV, CMV
pRC/RSV-E2-IL-18 E2, IL-18 RSV, CMV
pRC/RSV-E2-CD40L E2, CD40L RSV, CMV
Tab. 3-1: Übersicht über die hergestellten Einzelkonstrukte. Die Tabelle enthält alle
hergestellten Konstrukte mit ihren jeweils inserierten Sequenzen und den zugeordneten
Promotoren.
3.2 Überprüfung der in vitro Expression der DNA-Vakzine-
Konstrukte
Vor dem Einsatz der Plasmide im Tier sollte deren Funktionsfähigkeit in vitro
überprüft werden.
3.2.1 In vitro Transkriptionsanalyse der DNA-Vakzine-Konstrukte
In allen verwendeten CMV-Transkriptionseinheiten war ein T7-Promotor enthalten,
der es ermöglichte, eine in vitro Transkription durchzuführen, um die Funktionalität
der Plasmide bezüglich der inserierten Sequenzen zu überprüfen. Zur Durchführung
einer “Run-Off“-Transkription wurden die Plasmide in einem ersten Schritt linearisiert
(Tab. 3-2) und anschließend mittels T7-RNA-Polymerase transkribiert. Da die
pRC/RSV-E2-IL-12/ IL-18/ CD40L-Plasmide im Gegensatz zu den pcDNA4HisMax-
E2-IL-12/ IL-18/ CD40L-Plasmiden nur einen, vor der Expressionskassette der
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