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ERGEBNISSE darstellten. In einem Vorversuch wurde zuerst die zell-spezifische Transfektionseffizienz einzelner Methoden mit Hilfe des EGFP-Expressionsplasmides pEGFP-N3 ausgetestet werden. Für transiente Transfektionen von Plasmid-DNA in MAX-Zellen wurde hauptsächlich die Liposomen-vermittelte Transfektion mittels Effectene angewandt, da sich zeigte, dass die Effizienz bei anderen Transfektionsmethoden geringer war (Daten nicht gezeigt). Zur Analyse der in vitro Funktionalität der E2-IL-12/ IL-18/ CD40L-Konstrukte wurden MAX-Zellen mit je 1µg der Plasmid-DNA transfiziert und die Expression des E2-Glykoproteins durch cytoplasmatische Immunfluoreszenzanalyse nach 24 h überprüft. Hierfür wurde ein E2-spezifischer monoklonaler Maus-Antikörper (a18) [Weiland et al., 1990] als Primär- und ein Ziege-anti-Maus IgG-DTAF-gekoppelten Antikörper als Sekundärantikörper verwendet. Als Negativkontrolle wurden MAX-Zellen mit einer Mischung aus pcDNA4HisMax- und pRC/RSV-Plasmid transfiziert. Für die Positiv- kontrolle erfolgte eine Infektion der MAX-Zellen mit CSFV (Stamm Glentorf, MOI:1). Beide Kontrollen wurden analog zu den E2-IL-12/IL-18/CD40L-Konstrukten gefärbt. Eine Expression des E2-Glykoproteines konnte für alle Konstrukte, außer für das Kontrollplasmidgemisch (pcDNA4HisMax und pRC/RSV), nachgewiesen werden. Ein promotorspezifischer Unterschied der Expression des E2-Glykoproteines war nicht feststellbar, da beide Vektorsysteme im gewählten Zellkulturtestsystem annähernd gleiche Expressionsraten zeigten (Abb. 3-8). 28
ERGEBNISSE Abb. 3-8: E2-Expressionsanalyse der E2-IL-12/IL-18/CD40L-Konstrukte. Photographische Aufnahme der E2-Expression 24 h nach Transfektion mit je 1µg der E2-IL-12/IL-18/CD40L- Konstrukte. Die jeweilige Konstruktbezeichnung ist als Bildunterschrift dargestellt. Als Negativkontrolle dienten MAX-Zellen, die mit einem Gemisch aus pcDNA4HisMax- und pRC/RSV-Plasmid transfiziert wurden. Für die Positivkontrolle wurden MAX-Zellen mit CSFV (Stamm Glentorf, MOI:1) infiziert. Zusätzlich wurden die Zellkerne der Zellen mit Propidiumjodid (rot) angefäbt. 3.2.3 CD40L- Expressionsanalyse mittels Immunfluoreszenz Nachdem für alle Konstrukte der Nachweis der Expression des CSFV-spezifischen E2- Glykoproteines gelungen war, sollte nun die Expression der Zytokine und immun- stimulatorischen Moleküle untersucht werden. Da für die Untersuchungen der CD40L- Expression ebenfalls ein monoklonaler Antikörper zur Verfügung stand, wurde auch für die Konstrukte pcDNA4HisMax-E2-CD40L und pRC/RSV-E2-CD40L eine Immunfluoreszenzanalyse durchgeführt. Die Spezifität des monoklonalen anti human- CD40L-Antikörpers konnte in Vorversuchen durch Kreuzreaktion mit rekombinantem porcinen CD40L nachgewiesen werden (siehe 3.4.4). Die MAX-Zellen wurden analog zu 3.2.2 mit dem pcDNA4HisMax-E2-CD40L- bzw. pRC/RSV-E2-CD40L-Plasmid transfiziert und mittels Oberflächenimmunfluoreszenzanalyse untersucht. 29
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DISKUSSION E2-Poxvirus [Hahn, 2001]
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DISKUSSION Der Nachweis der sekreti
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DISKUSSION Testsystemen nach erfolg
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DISKUSSION Versuchsansätzen wurde
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DISKUSSION Zell-Depletion zu verzei
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DISKUSSION p35-Untereinheit zeigte
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5 MATERIAL MATERIAL 5.1 Bakterienst
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● Linker MATERIAL SmaI SV40 Hpa I
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MATERIAL Ziege-anti-Kanninchen IgG,
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Transfektionsmethoden METHODEN •
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METHODEN 12000 rpm). Nach den Extra
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METHODEN Reaktions“kugeln“ enth
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METHODEN peratur inkubiert. Nach Zu
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METHODEN konstante Geltemperatur vo
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METHODEN 6.5.2 RNA-Agarosegelelektr
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METHODEN 6.6.2 Diskontinuierliche S
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METHODEN Nitrozellulosemembran in 3
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METHODEN induzierbare Expression de
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METHODEN Reinheit und ihren Protein
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METHODEN ● Organe: Je 500 mg eine
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METHODEN stellt ein relatives Maß
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ANHANG 610 630 650 TCGGAGAGAATCTTAC
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LITERATUR Birnboim, H.C., Doly, J.
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LITERATUR D´Andreas, A., Rengaraju
Seite 153 und 154:
LITERATUR Gately, M.K., Warrier, R.
Seite 155 und 156:
LITERATUR Harkness, J. W. & Roeder,
Seite 157 und 158:
LITERATUR Kobayashi, M., Fitz, L.,
Seite 159 und 160:
LITERATUR Makoff, A.J., Oxer, M.D.,
Seite 161 und 162:
LITERATUR Nobiron, I., Thompson, I.
Seite 163 und 164:
LITERATUR Ruiz, P.J., Garren, H., R
Seite 165 und 166:
LITERATUR Sypek, J.P., Chung, C.L.,
Seite 167 und 168:
LITERATUR Wei, W.Z., Shi, W.P., Gal
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