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METHODEN
6.12.2.3 Nachweis der IL-12 Expression stabiler 293-Zelllinien mittels IFN-γ
Produktion nativer PBMC
Zum Nachweis der IL-12 Expression stabiler 293-Zelllinien wurden je 100 µL Zellkulturüberstände
der nativen und IL-12 exprimierenden 293-Zelllinien mit 3x10 6
PBMC für 18 h in MEM-Medium mit 1 µg/ml Conavalin A inkubiert. Für die
Kompetition wurden die Zellkulturüberstände vor Zugabe der PBMC 1:80 mit einem
anti IL-12-Antiserum versetzt und über Nacht bei 4 °C inkubiert.
Die Zellkulturüberstände wurden anschließend in einem IFN-γ-ELISA (siehe 6.13.3)
analysiert.
6.12.2.4 IFN-γ-ELISPOT-Test
Zu einer Quantifizierung von IFN-γ freisetzenden Zellen wurde der IFN-γ ELISPOT-
Test eingesetzt.
Eine Nitrozelluloseplatte wurde mit einem monoklonalen Antikörper gegen porcines
IFN-γ (5 µg/ml in PBS-A; 100 µl/Vertiefung) über Nacht bei 4 °C beschichtet. Die
Vertiefungen wurden mit PBS-A gewaschen und mit 200 µl Lymphozyten-
kulturmedium für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. 1x10 6 PBMC/Mikrokultur
aus CSFV infizierten Schweinen wurden mit 100 µl Virussuspension (5x10 4 TCID50
CSFV-Glentorf/Vertiefung) in zwei Parallelansätzen in der mit Antikörper
beschichteten Platte inkubiert. Als Kontrollen dienten PBMC, die mit Überstand aus
Medium-infizierten Zellen inkubiert wurden. Die Platte wurde für 44-48 Stunden bei
37 °C in 5 % CO2 inkubiert. Nach Waschen der Platten mit PBS-A erfolgte die Zugabe
eines in PBS-A verdünnten anti-IFN-γ-Kaninchenserums (2,5 µg/ml). Nach
einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Platte mit PBS-A gewaschen
und ein Peroxidase-gekoppelter Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (1:200 in PBS-A
verdünnt) zugegeben. Nach Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die
Vertiefungen mit PBS-A gewaschen. Die Färbung der IFN-γ spezifischen Spots
erfolgte durch Zugabe von 3,3´-Diaminobenzidine (DAB). Nach 4-7 min wurde die
Reaktion durch Waschen mit PBS-A und dH2O gestoppt. Die Platten wurden
anschließend über Nacht getrocknet und die Spots mit einem Stereomikroskop
ausgezählt.
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