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ERGEBNISSE
3.2.4 Nachweis der IL-18- und IL-12-Expression durch funktionelle NK-
Assays
Ein Nachweis der IL-12- und IL-18-Expression durch Immunfluoreszenzanalyse war,
bedingt durch die Sekretion von IL-12 und IL-18 in den Zellkulturüberstand nicht
möglich.
Es wurde daher ein funktioneller Assay durchgeführt, bei dem die Expression von IL-
12 und IL-18 indirekt nachgewiesen werden konnte. Bei diesem funktionellen NK
(natural killer) -Assay wird die Steigerung der zytolytischen Aktivität von NK durch
IL-12 bzw. IL-18 gemessen. Dazu wird eine humane Tumorzelllinie (K562) mit 51 Cr
markiert und anschließend mit PBMC, die auch NK-Zellen enthalten, inkubiert. Diese
NK-Zellen lysieren die humane Tumorzelllinie abhängig von ihrer Aktivierung. Zur
Überprüfung der IL-12- und IL-18-Expression wurden die Überstände der mit den IL-
12- und IL-18-Plasmiden (pcDNA4HisMax-E2-IL-12/IL-18, pRC/RSV-E2-IL-12/IL-
18) transfizierten MAX-Zellen zugesetzt. Die im Überstand enthaltenen Zytokine
stimulieren die zytolytische Aktivität der NK-Zellen, so dass nach 18 h die
Radioaktivität im Überstand (lysierte Zellen setzten 51 Cr frei) ein direktes Maß für die
Aktivierung der NK-Zellen darstellt. Als Kontrollen wurden PBMC und Tumorzellen
mit Überständen von MAX-Zellen versetzt, die zuvor mit einem E2-Vakzin-
Vektorgemisch (E2-pcDNA4HisMax und E2-pRC/RSV) transfiziert wurden. Zur
Kontrolle der Spontanlyse wurden Tumorzellen mit PBMC ohne Zusatz von
Überständen inkubiert. Als Positivkontrolle für IL-12 stand Zellkulturüberstand zur
Verfügung, der rekombinantes porcines adeno-IL-12 enthielt.
In Abb. 3-10 sind die Ergebnisse der NK-Assays zusammengefasst. Für die IL-12- und
IL-18-Ansätze konnte gezeigt werden, dass die E2-Konstrukt-Zellüberstände im
Verhältnis zur Spontanlyse des Testsystems eine stimulierende Wirkung auf die NK-
Zellen ausübten. Weiterhin konnte für die E2-IL-12-Konstrukte eine Erhöhung der
Spontanlyse um ca. 35 % im Verhältnis zu den Überständen der E2-Konstrukte
beobachtet werden. Vergleichbare Werte wurden auch für die Stimulation mit
rekombinantem porcinen adeno-IL-12 beobachtet. Für die Überstände der E2-IL-18-
Konstrukte konnte eine Erhöhung der spezifischen Lyse von ca. 25% im Verhältnis zu
den Überständen der E2-Konstrukte festgestellt werden. Außerdem war der
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