PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

METHODEN
peratur inkubiert. Nach Zugabe von 1 l Lösung B wurde kurz durchmischt, anschlie-
ßend 1,4 l kalte Lösung C zupipettiert und wieder geschüttelt. Es folgte eine Inkuba-
tion für 20-30 Minuten auf Eis. Die dadurch ausgefällte hochmolekulare DNA sowie
Protein wurden abzentrifugiert (10000 rpm, 25 Min., 4 � C, Rotor JA 10), die im
Überstand enthaltene Plasmid-DNA mit 0.6 Volumen Isopropanol bei Raumtempera-
tur für 30 Minuten gefällt und anschließend pelletiert (8000 rpm, 20 Min., 4 � C, Rotor
JA 10). Das Pellet wurde kurz an der Luft getrocknet, in 150 ml dest. Wasser
aufgenommen und dreimal mit Phenol/Chloroform extrahiert (1Vol. Phenol, je 0.5
Vol. Phenol u. Chl., 1 Vol. Chl.; 3000 rpm, 5 Min., Minifuge T). Der letzte Überstand
wurde mit 3 Volumen Ethanol versetzt, die DNA eine Stunde bei -70 � C gefällt und
mit 70%igem Ethanol gewaschen. Nach Zentrifugation (12000 rpm, 20 Min., 4 � C,
Rotor JA 14) wurde das DNA-Pellet an der Luft getrocknet, in 9 ml CsCl in 20 mM
Tris/Cl pH 7.5 (R: 1.387) aufgenommen und in Quick-Seal-Tubes (5/8x3 inch, 16x76
mm) gefüllt. Es wurden 400 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml) zugegeben, die Tubes
DNA mit Paraffin austariert und verschweißt. Durch die anschließende
Dichtegradientenzentrifugation (50000 rpm, 20 h, 20 � C, Rotor TFT 65.13) erfolgte
eine Trennung der Plasmid-DNA von chromosomaler DNA und RNA. Unter UV
wurde die Plasmid-DNA-Bande abgezogen und einer zweiten Dichtegradientenzen-
trifugation unterzogen (Tubes: 1/2x2 inch; 60000 rpm, 4 h, 20 � C, Rotor VTi 65.2).
Eine nochmalige Zugabe von Ethidiumbromid war nicht nötig. Die Plasmidbande
wurde erneut abgezogen und das Ethidiumbromid durch mehrmaliges Ausschütteln
mit CsCl gesättigtem Isopropanol vollständig entfernt. Um das CsCl zu entfernen,
wurde die DNA gegen 5 mM Tris/Cl pH 7.5 dialysiert. Die Konzentration der Plas-
mid-DNA wurde photometrisch bei 260 nm bestimmt.
Lösung A: 50 mM Glukose
25 mM Tris/Cl pH 8.0
10 mM EDTA
2 mg/ml Lysozym vor Gebrauch zugeben
Lösung B: 0.1 N NaOH
1 % SDS
Lösung C: 3 M Na-Acetat pH 4.8 in 2 M Essigsäure
113