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DISKUSSION Die offensichtlichen Unterschiede der beiden E2-Grundkonstrukte in vivo widersprechen den im zellulären System gemachten Beobachtungen. Ein Zeichen dafür, dass die in wirtsspezifischen Zellkultursystemen gewonnenen Daten gerade bei immunologisch relevanten Fragestellungen nicht immer zur Evaluierung spezifischer Sachverhalte ausreichen. Die Insertion zusätzlicher immunstimulatorischer Moleküle in die E2-DNA-Vakzine führte, mit Ausnahme der E2-IL-12-Konstrukte, ebenfalls zur Ausbildung einer protektiven humoralen Immunantwort. Auch hier konnten CSFV-spezifische Antikörper vereinzelt schon ab dem 29. Tag post Immunisierung detektiert werden. Der größte Teil der Gruppen 7 (pcDNA4/HisMax- E2-IL-18) und 8 (pcDNA4/HisMax-E2-CD40L) zeigte signifikante Titer [Terpstra, 1988; van Rijn, 1996, Bouma, 1999] ab dem 50. Tag, d.h. nach der dritten Immunisierung. Die Auswertung der Serumneutralisationstests ergab für die E2-IL-18- bzw. E2-CD40L-Konstrukte vergleichbare Werte wie bei Experimenten mit einer E2- DNA-Vakzine allein [Andrew, 2000] bzw. einer Kombination aus einer E2-DNA- Vakzine und einem rekombinanten E2-Adenovirus (prime boost) [Hammond, 2001]. Eine Ausnahme bildete das Tier 835 (pcDNA4HisMax-E2-CD40L), bei dem trotz nicht vorhandener neutralisierender Antikörper die Ausbildung einer protektiven CSFV-spezifischen Immunität prä challenge detektiert werden konnte. Ähnliche Beobachtungen von vereinzelt auftretenden Schutzwirkungen, die mit dem völligen Fehlen bzw. der nur sehr geringen Induktion neutralisierender Antikörpertiter korreliert sind, wurden bereits bei Experimenten mit rekombinantem E2-Vakziniavirus [Rümenapf, 1991] bzw. rekombinantem E2-Adenovirus [Hammond, 2000] beschrieben. Ob die entsprechende Stimulation in diesen Fällen auf das virale Vektorsystem zurückzuführen ist oder andere Faktoren involviert sind, ist bisher unbekannt. Das zusätzlich inserierte IL-12 bewirkte eine Repression der humoralen Immunantwort. Dieser negative Einfluss des IL-12 ist auf seine Wirkung als klassisches TH1-Zytokin und dem damit verbundenen Shift der Immunantwort wie schon für HCV beschrieben [Shan, 1999], zurückzuführen. Auch in anderen 86
DISKUSSION Versuchsansätzen wurde eine Beeinflussung der Immunantwort durch IL-12 beobachtet [Schirmbeck, 2001]. Daher zeigte nur ein Tier (807) der Gruppe 6 (pcDNA4/HisMax-E2-IL12) signifikante Antikörpertiter vor der CSFV-Infektion. Die hohe Sterblichkeit der Tiere (50%) belegt damit, dass obwohl CSFV-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten in die Ausbildung einer CSFV-spezifischen Immunantwort involviert sind [Pauly, 1995], die tragende Rolle einer Protektion durch die humorale Immunantwort übernommem wird. Im Gegensatz dazu muss für das BVDV zur Ausbildung einer effektiven Schutzwirkung durch DNA-Vakzine, sowohl die Induktion der humoralen- als auch zellulären Immunantwort erfolgen [Cortese, 1998; Harpin, 1999]. Nach der CSFV-Infektion zeigten alle Tiere der Gruppen 7 (pcDNA4HisMax-E2-IL- 18) und 8 (pcDNA4HisMax-E2-CD40L) sowie 2 Tiere der Gruppe 6 (pcDNA4HisMax-E2-IL-12) und der Kontrollgruppe (pcDNA4/HisMax) einen Anstieg der CSFV-spezifischen Antikörpertiter. Der überraschende Tod des E2- Kontrolltieres 806 (Gruppe 5) ist vermutlich auf andere Faktoren zurückzuführen, da das Tier prä und post challenge signifikante neutralisierende Antiköpertiter aufwies und alle ebenso immunisierten Tiere der vorangegagenen Versuchsteile überlebten. Der klinische Verlauf der Infektion manifestierte sich bei der Kontrollgruppe (4) sowie den beiden Tieren der Gruppe 6 (pcDNA4HisMax-E2-IL-12) mit den klassischen Symptomen [Fields, 1996], gefolgt vom vorzeitigen Ableben sechs bzw. sieben Tage post challenge. Besonders auffällig ist die Korrelation zwischen neutralisierenden Antikörpertitern und den Temperaturverläufen in der Gruppe 6: die Tiere ohne neutralisierende Antikörper zeigten hohe Fieberwerte, während es bei den Tieren mit Antikörpern nur zur Ausbildung einer geringen Temperaturerhöhung kam. Die Fieberkurven der Tiere der Gruppen 7, 8 und 5 hingegen sind unauffällig, wobei ein Tier der Gruppe 7 und zwei Tiere der Gruppe 8 einen eintägigen Temperaturanstieg von 40,5 o C aufwiessen. Die vereinzelt auftretende Temperaturerhöhung der immunisierten Tiere (Gruppen 7 und 8) konnte ebenso nach Immunisierung mit einer E2-DNA-Vakzine [Andrew, 2000] bzw. einem rekombinanten E2-Adenovirus [Hammond, 2000] beobachtet werden. Obwohl bei Verwendung einer Kombination aus einer E2-DNA-Vakzine und einem rekombinaten E2-Adenovirus eine Reduktion 87
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DNA-Vakzinierung gegen classical sw
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Die vorliegende Arbeit wurde unter
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3.3 Analyse der DNA-Vakzine-Konstru
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6.5 Präparation und Analyse von RN
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ABKÜRZUNGEN 6xHis Hexahistidin Abb
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1 ZUSAMMENFASSUNG ZUSAMMENFASSUNG D
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2 EINLEITUNG 2.1 DNA-Immunisierung
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EINLEITUNG Proben erforderlich) ein
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EINLEITUNG Zellproliferation und Di
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2.3 Interleukin 18 2.3.1 Struktur E
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2.4 CD40-Ligand 2.4.1 Struktur EINL
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EINLEITUNG 2.5.2 Genomorganisation
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3 ERGEBNISSE 3.1 Konstruktherstellu
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ERGEBNISSE 3.1.2 Herstellung der E2
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ERGEBNISSE Abb. 3-3: RT-PCR für di
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ERGEBNISSE Abb. 3-4: Konstruktion d
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ERGEBNISSE Zur Entnahme der komplet
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ERGEBNISSE Nach Abschluß der Konst
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ERGEBNISSE Abb. 3-7: Gelanalyse der
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ERGEBNISSE Abb. 3-8: E2-Expressions
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ERGEBNISSE 3.2.4 Nachweis der IL-18
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%spezifische Lyse %spezifische Lyse
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Seite 51 und 52: • Serumneutralisationstest ERGEBN
Seite 53 und 54: ERGEBNISSE • IgG1/IgG2-isotypspez
Seite 55 und 56: ERGEBNISSE • IFN-γ-ELISA und IFN
Seite 57 und 58: ERGEBNISSE Deshalb wurde im dritten
Seite 59 und 60: ERGEBNISSE Vergleich der Tiere der
Seite 61 und 62: ERGEBNISSE Konstrukte. Daher wurden
Seite 63 und 64: ERGEBNISSE Antikörpertiter vor -un
Seite 65 und 66: ERGEBNISSE 3.3.3.2 Klinischer Verla
Seite 67 und 68: Temperatur 42 41,5 41 40,5 40 39,5
Seite 69 und 70: ERGEBNISSE Gruppe Tier-Nr. 4. Tag 7
Seite 71 und 72: ERGEBNISSE Antikörper und virusfre
Seite 73 und 74: ERGEBNISSE mehrerer anderer Zellfra
Seite 75 und 76: ERGEBNISSE Nach Transformation von
Seite 77 und 78: ERGEBNISSE Abb. 3-27: Klonierungssc
Seite 79 und 80: ERGEBNISSE 3.4.2.2 Expression der p
Seite 81 und 82: ERGEBNISSE Aufgrund der geringen Au
Seite 83 und 84: ERGEBNISSE CD40L (Abb. 3-35 A) spez
Seite 85 und 86: ERGEBNISSE Abb. 3-36: Analyse resis
Seite 87 und 88: ERGEBNISSE Abb. 3-37: Analyse der I
Seite 89 und 90: 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Seite 91 und 92: ERGEBNISSE Abb. 3-40: E2-Expression
Seite 93 und 94: DISKUSSION E2-Poxvirus [Hahn, 2001]
Seite 95 und 96: DISKUSSION Der Nachweis der sekreti
Seite 97: DISKUSSION Testsystemen nach erfolg
Seite 101 und 102: DISKUSSION Zell-Depletion zu verzei
Seite 103 und 104: DISKUSSION p35-Untereinheit zeigte
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Seite 113 und 114: 5.10.1 Zentrifugen MATERIAL Biofuge
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Seite 127 und 128: METHODEN konstante Geltemperatur vo
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LITERATUR Birnboim, H.C., Doly, J.
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LITERATUR Wei, W.Z., Shi, W.P., Gal
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Persönliche Daten Name: Daniel Wie
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