PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

6.1.3 Transformation
METHODEN
Für die Transformation wurde 0,1-1 ng Plasmid-DNA oder 5 µl Ligationsansatz zu je
100 µl kompetenter Bakterien gegeben. Der Ansatz wurde für 30 min auf Eis
inkubiert. Nach einem 2-minütigen Hitzeschock bei 42°C und 2 min auf Eis erfolgte
die Zugabe von 1 ml antibiotikafreiem LB-Medium und eine anschließende Inkubation
des Ansatzes für 45 min bei 37°C. Nach kurzer Zentrifugation (4000 rpm, 5 min)
wurde das Pellet in 100-200 µl antibiotikafreiem LB-Medium resuspendiert, auf LB-
Selektionsagar ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
6.2 Eukaryotische Zellkultur
6.2.1 Arbeiten mit humanen und porcinen Zelllinien
6.2.1.1 Kultivierung und Kryokonservierung
Die Kultivierung der adhärent wachsenden Zellen erfolgte standardmäßig in einem
Zellkulturbrutschrank bei 37°C in feuchter Atmosphäre und mit 5% CO2. 293-Zellen
wurden hierbei in MEM, MAX Zellen in BFA 34 kultiviert. Die Medien wurden
jeweils mit 1 mM Glutamin, 10% FCS und Penicillin G/Streptomycin (je100 U/ml)
komplementiert. Bei Erreichen einer Konfluenz von etwa 95% wurden die Kulturen im
Verhältnis 1:4 bis 1:5 subkultiviert. 293- und MAX Zellen wurden durch Inkubation
mittels Trypsin-Lösung bei 37°C abgelöst.
Für die Kryokonservierung wurden die Zellen abgelöst, abzentrifugiert (1000 rpm,
5 min), 2x mit PBS gewaschen und in Aliquots von 5x10 6 bis 1x10 7 Zellen in 1 ml
90% FCS/10% DMSO bei –70°C langsam eingefroren. Die Langzeitlagerung erfolgte
in flüssigem Stickstoff. Eingefrorenen Zellen wurden im Wasserbad bei 37°C bis zum
Gefrierpunkt aufgetaut und mit 10-20 ml Medium in T75-Zellkulturflaschen gegeben.
Nach 12-24 Stunden wurde das Medium gewechselt und die Zellen bis zur Konfluenz
kultiviert.
Trypsin-Lösung: 3,3 mg/ml EDTA, 2,6 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4,
8 mM Na2HPO2, 136 mM NaCl, 0,25% Trypsin,
16 mg/ml Phenolrot, pH 7,2
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