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6 METHODEN
6.1 Prokaryotische Zellkultur
METHODEN
6.1.1 Kultivierung und Kryokonservierung von Escherichia coli
Der verwendete E. coli Stamm XL1-Blue wurde in LB-Medium angezogen oder auf
LB-Agarplatten kultiviert. Die Inkubation erfolgte bei 37°C über Nacht.
Suspensionskulturen wurden bei 200 rpm geschüttelt. Für eine Kryokonservierung
wurden 500 µl Kultur mit 30 % Glycerin versetzt, in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei -70°C gelagert.
LB-Medium: 10 g Bacto Trypton, 5 g Bacto Hefeextrakt, 5 g NaCl,
ad 1 l H2O; pH 7,5
LB-Agar: LB-Medium mit 1,5% Agar
Selektionsmedien: 100 µg/ml Ampicillin, 25 µg/ml Kanamycin,
12 µg/ml Tetracyclin, 25 µg/ml Zeocin
6.1.2 Herstellung Transformations-kompetenter E.coli
Zur Herstellung transformationskompetenter E.coli wurde LB-Medium mit einer
E.coli Übernachtkultur 1:100 angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 von etwa 0,4
geschüttelt. Nach Abkühlen auf Eis wurden die Bakterien pelletiert (4000 rpm, 5 min,
4°C), in 0,5 Volumen eiskalter 50 mM CaCl2-Lösung aufgenommen und 30 min auf
Eis inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation (4000 rpm, 30 s, 4°C) wurde das
Bakterienpellet in 0,05 Volumen eiskalter 50 mM CaCl2-Lösung vorsichtig
resuspendiert. Die kompetenten Bakterien wurden daraufhin entweder direkt zur
Transformation eingesetzt oder nach Zugabe von 20 % Glycerin zu je 200 µl
aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C bis zur Verwendung
gelagert.
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