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METHODEN
6.4.5 Abdau überhängender 5´ und 3´ Enden
Nach Spaltung von DNA enstandene überhängende Einzelstrang-Enden wurden, wenn
nötig, mit Hilfe der Mung Bean Nuklease abgedaut. Hierzu wurde die DNA mit 1x
Mung Bean Nuklease Puffer zu einer Konzentration von 0,1 µg/µl verdünnt und mit
Mung Bean Nuklease (1 U pro µg DNA) für 30 min bei 30°C inkubiert. Der
Reaktionsansatz wurde mittels Phenol/Chloroform-Extraktion inaktiviert, die DNA mit
Ethanol gefällt.
6.4.6 Phosphorylierung von DNA
Um Ligationen linearisierter Vektoren mit synthetischen Oligonukleotid-Linkern oder
PCR-Fragmenten zu ermöglichen, wurden deren 5´Enden mittels der T4
Polynukleotidkinase (PNK) phosphoryliert.
Reaktionsansatz: 1-5 µg DNA
5 µl T4-PNK-Puffer, 10x
1mM rATP
10 U T4-PNK
ad 50 µl H2O
Der Reaktionsansatz wurde für 30 min bei 37°C inkubiert, anschließend durch
Erhitzen (10 min, 68°C) inaktiviert, Phenol/Chloroform extrahiert und Ethanol
präzipitiert.
6.4.7 Dephosphorylierung von DNA
Zur Verhinderung von Religationen linearisierter Vektorfragmente bei Klonierungen
wurden die 5´ terminalen Phosphatgruppen der DNA-Moleküle mittels der
Alkalischen Phosphatase aus Kälberdarm (CIP) entfernt. Der Reaktionsansatz wurde
für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
Reaktionsansatz: 1-5 µg linearisierte Plasmid-DNA
5 µl Phosphatasepuffer, 10x
1 U CIP
ad 50 µl H2O
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