PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

METHODEN
10x DNA-Probenpuffer: 20 mM EDTA, pH 8,0, 50% Glycerin, 0,2% OrangeG,
0,2% Xylencyanol, 0,1% Bromphenolblau
6.4.2 Isolierung von DNA aus Agarose-Gelen
Nach Auftrennung in einem präparativen Agarosegel und Färbung mit
Ethidiumbromid wurden gewünschte DNA-Fragmente unter langwelligem UV-Licht
(λ=366 nm) ausgeschnitten und mittels des QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) nach
Angaben des Herstellers aus dem Gel isoliert.
6.4.3 Restriktionsverdau von DNA
Für die Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen wurde für einen analytischen
Ansatz 0,5-1 µg DNA in 20 µl, für einen präparativen Ansatz 5 µg DNA in 100 µl
Reaktionsvolumen für 1-6 Stunden bei entsprechender Temperatur im Wasserbad
inkubiert. Pro µg DNA wurden 1-3 U Enzym eingesetzt. Die Reaktions- und
Inkubationsbedingungen wurden entsprechend den Angaben des Enzymherstellers
gewählt. Die Überprüfung der DNA-Spaltungen erfolgte auf analytischen
Agarosegelen.
6.4.4 Auffüllen zurückgesetzter 3´ Enden
Zur Erzeugung glatter („blunt“) DNA-Enden wurden zurückgesetzte 3´Enden mittels
des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase I aus E.coli aufgefüllt. Der
Reaktionsansatz wurde für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend
nach Zugabe von 10 mM EDTA für 10 min bei 75°C hitzeinaktiviert.
Reaktionsansatz: 1-5 µg DNA
10 µl EcoPol-Puffer, 10x
33 µM dNTPs
5 U DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment
ad 100 µl H2O
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