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LC low control µ mikro m milli M molar (mol/ l) MCS multiple cloning site MEM Minimalmedium MHC Haupthisokompatibilitätskomplex min Minute moi multiplicity of infection mRNA messenger RNA NK-Zellen Zellen mit natürlicher Killeraktivität NS non structural NTA Nitrilotriacetat N-Terminus Amino-Terminus NTR nichttranslatierte Region OD optische Dichte ORF open reading frame p pico PAA Polyacrylamid PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PBS phoshat bufferd saline PCR Polymerasekettenreaktion PE Phycoerythrin RIP Radioimmunpräzipitation RNA Ribonukleinsäure Rnase Ribonuklease rpm revolutions per minute RT Reverse Transkriptase RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat SSC Seitwärtsstreulicht Tab. Tabelle TCID tissue culture infectous dose TE Tris-EDTA-Puffer TEMED Tetramethylethylendiamin TRIS Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan U Unit: Einheit für Enzymaktivität ü.N. über Nacht UV Ultraviolett V Volt Vol. Volumen W Watt Für die Bezeichnung von Nukleotiden und Aminosäuren wurden die international gebräuchlichen IUB-Einbuchstaben-Codes verwendet.
1 ZUSAMMENFASSUNG ZUSAMMENFASSUNG Das Klassische Schweinepest Virus (CSFV) verursacht global eine der wirtschaftlich bedeutensten Tierseuchen. Die eingesetzten klassichen Vakzinen gegen CSFV, die entweder aus attenuierten oder inaktivierten Viren bestehen, erlauben keine serologische Unterscheidung zwischen vakzinierten und infizierten Tieren. Aus diesem Grund wurden von der EU Bekämpfungsmaßnahmen erlassen, die auf einem Vakzinationsverbot und der Ausmerzung infizierter Bestände beruhen. DNA- Vakzinen und Peptidvakzinen könnten als Alternative zu den beschriebenen klassischen Vakzinen eingesetzt werden. Das Hauptziel dieser Arbeit, bestand daher in der Herstellung einer wirksamen CSFV- spezifischen DNA-Vakzine. Hierfür wurde das E2-Glykoprotein des CSFV in eine Reihe verschiedener eukaryontischer Expressionsvektoren (pcDNA4HisMax und pRC/RSV) kloniert die sich in der Auswahl der verwendeten Promotoren (CMV oder RSV) sowie in den zusätzlich inserierten Genen von Zytokinen und immunstimulatorischen Molekülen (IL-12, IL-18, CD40L) unterschieden. Die anschließende Überprüfung der Expression der E2, IL-12, IL-18 und CD40L-Gene, in den Konstrukten, erfolgte mittels Transfektion in Zellen und anschließender Immunfluoreszenzanalyse bzw. durch funktionelle Tests. In den Vakzinierungsversuchen im Schwein wurde in einem ersten Schritt die Applikationsart (intramuskulär (i.m.) oder intradermal (i.d.)) sowie die Infektionsdosis optimiert, wobei sich die intramuskuläre Injektion als effektivere Applikationsart erwies. Danach wurde die Schutzwirkung der E2-Grundkonstrukte im Verhältnis zur Schutzwirkung von E2-Konstrukten die zusätzlich die Sequenz eines immunstimulatorischen Moleküls (IL-12, IL-18, CD40L) enthielten analysiert. Hierbei zeigten sich deutliche Unterschiede in der Wirksamkeit der einzelnen Konstrukte. Während Immunisierungen mit dem pcDNA4HisMax-E2-IL-12 Konstrukt zu einer Verschlechterung der induzierten E2-spezifischen humoralen Immunantwort und Überlebensrate im Verhältnis zu den E2-Grundkonstrukt führte, zeigten das 1
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Seite 3: Die vorliegende Arbeit wurde unter
Seite 6 und 7: 3.3 Analyse der DNA-Vakzine-Konstru
Seite 8 und 9: 6.5 Präparation und Analyse von RN
Seite 11: ABKÜRZUNGEN 6xHis Hexahistidin Abb
Seite 15 und 16: 2 EINLEITUNG 2.1 DNA-Immunisierung
Seite 17 und 18: EINLEITUNG Proben erforderlich) ein
Seite 19 und 20: EINLEITUNG Zellproliferation und Di
Seite 21 und 22: 2.3 Interleukin 18 2.3.1 Struktur E
Seite 23 und 24: 2.4 CD40-Ligand 2.4.1 Struktur EINL
Seite 25 und 26: EINLEITUNG 2.5.2 Genomorganisation
Seite 27 und 28: 3 ERGEBNISSE 3.1 Konstruktherstellu
Seite 29 und 30: ERGEBNISSE 3.1.2 Herstellung der E2
Seite 31 und 32: ERGEBNISSE Abb. 3-3: RT-PCR für di
Seite 33 und 34: ERGEBNISSE Abb. 3-4: Konstruktion d
Seite 35 und 36: ERGEBNISSE Zur Entnahme der komplet
Seite 37 und 38: ERGEBNISSE Nach Abschluß der Konst
Seite 39 und 40: ERGEBNISSE Abb. 3-7: Gelanalyse der
Seite 41 und 42: ERGEBNISSE Abb. 3-8: E2-Expressions
Seite 43 und 44: ERGEBNISSE 3.2.4 Nachweis der IL-18
Seite 45 und 46: %spezifische Lyse %spezifische Lyse
Seite 47 und 48: ERGEBNISSE 1998; Smooker, 1999]. De
Seite 49 und 50: ERGEBNISSE Von den Tieren wurden w
Seite 51 und 52: • Serumneutralisationstest ERGEBN
Seite 53 und 54: ERGEBNISSE • IgG1/IgG2-isotypspez
Seite 55 und 56: ERGEBNISSE • IFN-γ-ELISA und IFN
Seite 57 und 58: ERGEBNISSE Deshalb wurde im dritten
Seite 59 und 60: ERGEBNISSE Vergleich der Tiere der
Seite 61 und 62: ERGEBNISSE Konstrukte. Daher wurden
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ERGEBNISSE Antikörpertiter vor -un
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ERGEBNISSE 3.3.3.2 Klinischer Verla
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Temperatur 42 41,5 41 40,5 40 39,5
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ERGEBNISSE Gruppe Tier-Nr. 4. Tag 7
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ERGEBNISSE Antikörper und virusfre
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ERGEBNISSE mehrerer anderer Zellfra
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ERGEBNISSE Nach Transformation von
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ERGEBNISSE Abb. 3-27: Klonierungssc
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ERGEBNISSE 3.4.2.2 Expression der p
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ERGEBNISSE Aufgrund der geringen Au
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ERGEBNISSE CD40L (Abb. 3-35 A) spez
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ERGEBNISSE Abb. 3-36: Analyse resis
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ERGEBNISSE Abb. 3-37: Analyse der I
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1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
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ERGEBNISSE Abb. 3-40: E2-Expression
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DISKUSSION E2-Poxvirus [Hahn, 2001]
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DISKUSSION Der Nachweis der sekreti
Seite 97 und 98:
DISKUSSION Testsystemen nach erfolg
Seite 99 und 100:
DISKUSSION Versuchsansätzen wurde
Seite 101 und 102:
DISKUSSION Zell-Depletion zu verzei
Seite 103 und 104:
DISKUSSION p35-Untereinheit zeigte
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5 MATERIAL MATERIAL 5.1 Bakterienst
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● Linker MATERIAL SmaI SV40 Hpa I
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MATERIAL Ziege-anti-Kanninchen IgG,
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5.8 Radioaktive Substanzen MATERIAL
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5.10.1 Zentrifugen MATERIAL Biofuge
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6.1.3 Transformation METHODEN Für
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Transfektionsmethoden METHODEN •
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METHODEN 12000 rpm). Nach den Extra
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METHODEN 6.4.5 Abdau überhängende
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METHODEN Reaktions“kugeln“ enth
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METHODEN peratur inkubiert. Nach Zu
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METHODEN konstante Geltemperatur vo
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METHODEN 6.5.2 RNA-Agarosegelelektr
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METHODEN 6.6.2 Diskontinuierliche S
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METHODEN Nitrozellulosemembran in 3
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METHODEN induzierbare Expression de
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METHODEN Reinheit und ihren Protein
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METHODEN ● Organe: Je 500 mg eine
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METHODEN 6.12.2.3 Nachweis der IL-1
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6.12.3.4 Serumneutralisationstest M
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METHODEN stellt ein relatives Maß
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ANHANG 610 630 650 TCGGAGAGAATCTTAC
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LITERATUR Birnboim, H.C., Doly, J.
Seite 151 und 152:
LITERATUR D´Andreas, A., Rengaraju
Seite 153 und 154:
LITERATUR Gately, M.K., Warrier, R.
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LITERATUR Harkness, J. W. & Roeder,
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LITERATUR Kobayashi, M., Fitz, L.,
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LITERATUR Makoff, A.J., Oxer, M.D.,
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LITERATUR Nobiron, I., Thompson, I.
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LITERATUR Ruiz, P.J., Garren, H., R
Seite 165 und 166:
LITERATUR Sypek, J.P., Chung, C.L.,
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LITERATUR Wei, W.Z., Shi, W.P., Gal
Seite 169:
Persönliche Daten Name: Daniel Wie
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