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• Transcription Inverse
La transcription inverse est réalisée avec l'enzyme M-MLV (Invitrogen). Les ADNc
sont synthétisés dans un mélange composé de tampon Tris/HCI à 50 mM (pH :8,3) contenant
75 mM de KCI, 3 mM de MgCI2, 2 /lg d'ARN totaux (correspondant à 1 /lg ARN à quantifier
et à 1 /lg d'ARN compétiteur), 0,5 mM de chacun des désoxynucléotides triphosphates
(Invitrogen), 0,02 g/L d'amorces aléatoires (Invitrogen), 5 mM de OTT, 5 unités de RNAsine
(Invitrogen) et 200 unités de M-MLV (Invitrogen). Le mélange est incubé à 37°C pendant 2
heures.
• Réaction de polymérisation en chaîne
La réaction est réalisée dans un mélange composé de tampon Tris/HCI à 20 mM
(pH :8,4) contenant 50 mM de KCI, 0,2 /lM de chacun des désoxynucléotides triphosphates
(Invitrogen), 0,4 /lM d'amorces sens et antisens, 1,5 mM de MgCb et 2,5 d'unités de Taq
Polymerase (Invitrogen).
2 f.lL du mélange de transcription inverse préalablement chauffés à 94°C pendant 30
secondes sont finalement ajoutés. La PCR est réalisée en 26, 30 ou 32 cycles selon le gène
étudié (tableau 4). Chaque cycle comprend la séquence suivante: 30s à 94°C, 30s 60°C,
30s à 72°C, suivie d'une élongation terminale de 5 min à 72°C.
• Digestion enzymatique des produits de PCR et quantification
D'une manière générale, 1° \-IL de produit d'amplification sont digérés par une
enzyme de restriction (tableau 4). Après digestion, le mélange est déposé sur un gel
d'agarose à 2% (p/v) préparé dans du TBE contenant 0,5 /lg/mL de bromure d'éthidium et
soumis à une électrophorèse. Les produits d'amplification et de digestion sont visualisés
sous lampe UV et leurs intensités respectives sont quantifiées (Geldoc, BioRad).
• Analyses statistiques
Les résultats obtenus ont été soumis à l'analyse de rang de Wilcoxon pour des
valeurs appariées (sain versus tumeur) [366]. La dispersion des valeurs obtenues ne suit pas
une distribution gaussienne; elle exclut par conséquent le test t de Student.
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