Ce document numérisé est le fruit d'un long travail approuvé par le ...
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incluses dans la <strong>par</strong>affine. Des sections de 5 /lm d'épaisseur sont montées sur des lames<br />
Superfrost puis séchées pendant 2 heures à l'étuve à 37°C. Les coupes sont dé<strong>par</strong>affinées<br />
<strong>par</strong> trois bains successifs de toluène pur, réhydratées <strong>par</strong> passage dans des bains d'alcool<br />
de concentration décroissante puis dans de l'eau.<br />
Chaque lot de coupes <strong>est</strong> encerclé <strong>par</strong> un film de silicone afin d'empêcher<br />
l'écou<strong>le</strong>ment des solutions. Les lames sont ensuite réhydratées dans du tampon PBS-Tween<br />
pendant 5 min, avant de recevoir l'anticorps primaire (dilution 1/400) pendant 1 nuit à 4°C<br />
dans une chambre humide. La révélation des comp<strong>le</strong>xes antigène-anticorps formés <strong>est</strong><br />
réalisée grâce au montage décrit précédemment (figure 17C). Nous avons utilisé un<br />
anticorps secondaire anti-lgG de lapin produit chez <strong>le</strong> porc et conjugué à la fluorescéine<br />
(dilution 1/100, porc anti-lgG de lapin/FITC, Jackson) et un anticorps tertiaire dirigé contre la<br />
fluorescéine (dilution 1/2000, chèvre anti-FITC de porc, Jackson). La révélation <strong>est</strong> réalisée à<br />
l'aide <strong>d'un</strong>e solution Fast-Red (Sigma).<br />
Immunocytochimie sur coupes en <strong>par</strong>affine des tissus provenant d'adénocarcinome<br />
colique adulte<br />
<strong>Ce</strong>tte technique a été utilisée dans <strong>le</strong> but d'analyser l'expression des PPAR ainsi que<br />
d'autres protéines au niveau d'adénocarcinomes coliques humains et des tissus sains situés<br />
à proximité des tumeurs. Nous avons utilisé <strong>le</strong>s antisera d'origine commercia<strong>le</strong> suivants:<br />
- antisérum dirigé contre <strong>le</strong>s isotypes de PPAR (anti-PPARy, anti-PPARa et anti-PPAR~, AB<br />
Regeant à la dilution 1/400),<br />
- anti-cytochrome-c (dilution 1/400 ; Chemicon International, Temacula, CA,USA),<br />
- anti-cytokératine 18 (dilution 1/200 ; Dako)<br />
- anti-Ki67 (1/200 ; Dako)<br />
Des prélèvements biopsiques sont fixés pendant 1 nuit à 4°C dans une solution formolée à<br />
10% (plv) diluée dans du tampon PBS puis inclus dans la <strong>par</strong>affine. Des sections de 5 /lm<br />
sont déposées sur lames Superfrost puis séchées pendant 2 heures à l'étuve à 3rC.<br />
• Mise en évidence des PPAR<br />
Les coupes sont dé<strong>par</strong>affinées dans 3 bains successifs de toluène pur, réhydratées<br />
<strong>par</strong> passage dans des bains d'alcool de concentration décroissante puis dans de l'eau. Un<br />
film de silicone <strong>est</strong> déposé autour de chaque section. Les lames sont immergées dans du<br />
tampon PBS. L'anticorps primaire dilué (dilution 1/400) <strong>est</strong> déposé sur chaque coupe,<br />
pendant une nuit dans une chambre humide et à 4°C.<br />
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