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EXPRESSION DES PPAR AU COURS DE LA DIFFÉRENCIATION DES CELLULES Caco-2 1. ANALYSE DE LA DIFFERENCIATION CELLULAIRE DES CELLULES Caco-2 Nous avons étudié les taux traductionnels et transcriptionnels des PPAR dans la lignée cellulaire Caco-2 à 5, 10 et 15 jours de culture. L'état de différenciation des cellules Caco-2 est analysé grâce à des marqueurs moléculaires de différenciation comme la saccharase/isomaltase et la phosphatase alcaline (2 enzymes de la bordure en brosse), l'acyl-CoA oxydase (AOX) et la catalase (2 enzymes peroxysomales). Les activités spécifiques de la saccharase/isomaltase et de la phosphatase alcaline augmentent durant la culture cellulaire (tableau 7). L'augmentation est de 2,3 et de 5,7 fois pour l'une et l'autre enzymes, respectivement, à 15 jours de culture comparativement aux valeurs de départ obtenues à 5 jours de culture. Les activités spécifiques de l'acyl-CoA oxydase et de la catalase augmentent de 1,7 et de 3 fois respectivement, entre 5 et 10 jours de culture. Les activités spécifiques de ces deux enzymes peroxysomales restent par la suite constantes entre 10 et 15 jours de culture. Les taux protéiques de la villine (marqueur moléculaire du développement de la bordure en brosse), de l'acyl-CoA oxydase (AOX), de l'enzyme peroxysomale bifonctionnelle (PBE), de la catalase et de la protéine membranaire peroxysomale de 70 kOa (PMP 70) ont été déterminés par la technique de Western blotting avec des anticoprs polyclonaux spécifiques (figures 25 et 26). Une bande unique de 90 kOa correspondant à la villine a été détectée avec les homogénats cellulaires. Son intensité augmente de 2,3 fois entre 5 et 15 jours de culture (figure 25). Trois bandes de 65,6, de 56 et de 42 kDa sont mises en évidence par l'anticorps anti-AOX. L'intensité de la bande correspondant à la sous-unité de 56 kDa augmente progressivement jusqu'à 3,3 fois au cours des 15 jours de culture (figure 26A). L'anticorps anti-PBE révèle la présence d'une bande unique de 70 kOa (figure 26B). Son intensité augmente de 2 fois au cours de la culture. Une bande de 60 kOa est détectée par l'anticorps anti-catalase; elle correspond à un monomère de l'enzyme. Au cours de la culture, l'intensité de cette bande augmente de 3 fois (figure 26C). Une augmentation plus faible est observée à 10 jours pour le taux protéique de PMP70 (figure 260). Cependant, cette augmentation n'est pas significative. 80
Enzymes Activités spécifiques 5 jours 10 jours 15 jours Saccharase/isomaltase 65,1 + 3,9 80,7 + 5,5 155,2 + 10,1 Phosphatase alcaline 0,95 ± 0,1 35,2 ± 4,1 55 + 4,5 Acyl coA oxydase 0,74 + 0,04 1,10 + 0,1 1,11 + 0,05 Catalase 12,3 ± 0,2 34,6 + 0,5 35,6 + 0,6 Tableau 7 : Mesure des activités spécifiques des enzymes saccharase /isomaltase, phosphatase alcaline, acyl coA oxydase et catalase des cellules Caco-2. Les activités spécifiques de chaque enzyme sont exprimées en mU/mg de protéines. Les valeurs correspondent à une moyenne ± écart-type à partir de trois expériences indépendantes. ANOVA et plusieurs tests comparatifs révèlent l'existence d'une différence significative pour les activités spécifiques de chaque enzyme mesurées entre 5 et 15 jours de culture
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VI. INTERVENTION DES PPAR DANS LA D
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