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Biosciences Clontech, NJ, USA) selon le protocole décrit précédemment. La G3POH est
utilisée comme témoin interne dans nos expériences. Le taux transcriptionnel de PPAR est
rapporté à celui de la G3PDH.
d. Quantification du taux d'ARNm par la technique de protection à la nucléase
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La technique de protection à la nucléase S1 [287] permet de quantifier le taux d'ARNm
d'un gène particulier. Nous avons utilisé cette technique pour quantifier les taux d'ARNm de
PPARa, 12 et y3. Des sondes ADN spécifiques de chaque isoforme de PPAR sont marquées
radioactivement et mises en présence d'extraits d'ARN totaux (Figure 18). Les complexes
ARN/ADN marqués se forment. La nucléase S1 élimine les brins d'ARN non hybridé à la
sonde ainsi que la sonde en excès. Les hybrides formés sont déposés sur un gel
d'acrylamide/bis acrylamide dans des conditions dénaturantes. Après migration, le gel est
exposé contre un film radiographique. Les signaux obtenus sont quantifiés.
Production de sondes ADNc spécifiques de chaque isoforme de PPAR
Le taux d'ARNm codant les PPAR a nécessité la production de sondes ADNc
spécifiques de chaque isotype de PPAR.
Ces sondes sont obtenues selon un protocole classique de RT-PCR. 51-1g d'ARN totaux
extraits des cellules Caco-2 ou de tissu adipeux humain sont transcrits en AONc par l'enzyme
M-MLV (Invitrogen, Paisley, Ecosse). Les ADNc sont synthétisés dans un volume de 20 1-11
contenant 1 /lg d'ARN, 0,5 mM de chacun des désoxynucléotides triphosphates (Invitrogen),
0,02 g/L d'hexaprimers (amorces aléatoires, Invitrogen), 5 mM de OTT, 5 unités de RNAsine
(Invitrogen) et 200 unités de transcriptase inverse M-MLV (Invitrogen) dans du tampon
Tris/HCI à 50 mM (pH :8,3) contenant 75 mM KCI et 3 mM MgCI2. Le mélange est incubé à
37°C pendant 2 heures.
2/lL du produit de RT préalablement chauffé à 94°C pendant 30 secondes, sont ajoutés au
mélange PCR composé de tampon Tris/HCI 20 mM (pH=8,3) contenant 50 mM KCI, 0,2 /lM de
chacun des desoxynucléotides triphosphates (Invitrogen), 0,4 /lM d'amorce sens et antisens
du gène étudié, 1,5 mM de MgCI2 et 2,5 unités de Taq Polymerase (Invitrogen). Le volume
final de la réaction est de 50I-lL.
L'amplification par PCR est réalisée en 30 cycles (95°C, 30s ; 60°C, 30s ; 72°C, 30s)
suivis d'une élongation terminale de 5 min à 72°C. Les amorces sens et antisens utilisées
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