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pBSKS+. pBSK+/hPPARa, PBSKS+/hPPARy2 et pBSKS+/hPPARy3 sont linéarisés par
BamH1 alors que pB8KS+/hPPARy1 et pBSKS+/G3PDH sont linéarisés par EcoR!.
Après extraction par un mélange phénol/chloroforme (1: 1) (v/v) puis extraction par un
mélange chloroforme/alcool isoamylique (49 :1) (v/v), les plasmides sont précipités en ajoutant
1/20 du volume d'acétate d'ammonium à 5 M (pH :7,5) et 3 à 5 volumes d'éthanol à 99 % (v/v)
froid. Les échantillons sont placés à -20°C pendant une heure, puis centrifugés à 4°C pendant
20 min à 10000 g. Le culot est lavé 2 fois en ajoutant 1 mL d'éthanol à 70 % (v/v), séché sous
vide (Speed Vac Concentrator, Savant), puis redissous dans 20 I-IL de tampon Tris/HCI à 10
mM (pH :7,5) contenant 1 mM EDTA (TE). La qualité et la quantité de plasmide linéaire sont
vérifiées par électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,8 % (p/v) préparé dans du TBE. Les
plasmides linéaires sont conservés à -20°C.
Le marquage des différentes sondes est réalisé par une technique classique
d'extension d'amorce [287]. A partir de 1 /-lg de plasmide linéaire, une sonde ADNc marquée
radioactivement avec du [a 32 P]-dCTP (Biosciences) est synthétisée dans un mélange
composé de tampon Tris/HCI à 20 mM (pH :8,4) contenant 50 mM de KCI, 0,4 mM de MgCI 2 ,
0,2 mM de chaque dNTP (Invitrogen) et 5 unités de Taq polymérase (Invitrogen), puis 45 /-lCi
de [a 32 P]-dCTP (Biosciences) sont ajoutés au mélange. Seule l'amorce antisens (1 mM) est
ajoutée au mélange final afin d'obtenir le brin ADNc marqué au [a 32 P]-dCTP. Après
amplification de 30 cycles (94°C, 30 s ; 60°C, 30 s ; 72°C, 30 s), puis une étape d'extension
finale à 72°C pendant 5 min, la phase aqueuse est incubée pendant 10 min à température
ambiante avec 1 mL de l'enzyme klenow (Promega). Après incubation, le mélange est
chauffé 5 min à 95°C puis immédiatement refroidi sur de la glace pendant 3 min. La sonde
marquée est déposée sur une colonne Sephadex G50 (Sigma) pré-équilibrée dans du TE. La
quantité de sonde ADNc marquée est appréciée à l'aide d'un compteur à scintillation
(Biosciences). La sonde marquée est conservée à -20°C jusqu'à son utilisation.
Technique de protection à la nucléase S1
5 I-Ig d'ARN totaux sont séchés sous vide puis dissous dans 30 I-IL de tampon
d'hybridation contenant du tampon Pipes/NaOH 40 mM (pH :6,4) contenant 0,4 M NaCI, 1
mM EDTA et 80 % (v/v) de Formamide désionisé. 10 5 cpm de sonde hPPAR marquée au
[a 32 P]-dCTP et 10 5 cpm de sonde G3PDH marquée au [a 32 P]-dCTP sont ajoutés à chaque
échantillon. L'ensemble est dénaturé 5 min à 90°C, placé à 4°C pendant 3 min, et incubé à
60°C pendant une nuit.
Après incubation, les échantillons reçoivent 300 I-IL d'un mélange froid contenant 0,28
M de NaCI, 50 mM d'acétate de sodium (pH :4,5), 4,5 mM de ZnS04, 20 I-Ig/mL d'ARNt et 50
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