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1 /-1g d'ARN extrait (de tissus ou de cellules en culture) sont transcrits en ADNc par
l'enzyme M-MLV (Invitrogen). Les ADNc sont synthétisés dans un mélange composé de
tampon Tris/HCI à 50 mM (pH :8,3) contenant 75 mM de KCI, 3 mM de MgCI2, 1 fl9 d'ARN,
0,5 mM de chacun des désoxynucléotides triphosphates, 0,02 flg/L des hexaprimers
(amorces aléatoires, Invitrogen), 5 mM de DTT, 5 unités de RNAsine (Invitrogen) et 200 U de
M-MLV (Invitrogen). Le mélange est incubé à 3rC pendant 2 heures.
2IJL de ce produit sont utilisés pour l'amplification par PCR selon le protocole décrit
précédemment (30 cycles chacun comportant: 30s à 94°C, 30s à 60°C, 30s à 72°C, suivis
d'une élongation terminale de 5 min à 72°C) en utilisant le couple de l'amorce PPAHy2 sens
sélectionnée à partir de l'exon B et de l'amorce PPARy antisens sélectionnée à partir de
l'exon 4 [84] (figure 19 et tableau 5). 1/10 du volume final est utilisé pour réaliser la deuxième
PCR dans les mêmes conditions. Les amorces utilisées sont PPARy2 sens (amorce
sélectionnée à partir de l'exon B) et PPARy2 anti-sens (amorce sélectionnée à partir de
l'exon1) (figure 19 et tableau 5).
Le produit d'amplification est déposé sur un gel d'agarose à 2% (plv), soumis à une
électrophorèse et visualisé sous lampe UV puis quantifié (GeIDoc, BioRad). L'intensité du
signal est rapportée à celle de la G3PDH, marqueur utilisé en tant que témoin interne.
Parallèlement, le produit d'amplification est digéré par l'enzyme Hind Il pendant une heure à
37°C. Les produits de digestion sont déposés sur un gel d'agarose à 2% (plv), soumis à une
électrophorèse et visualisés sous lampe UV puis quantifiés (GelDoc, Biorad).
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