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étudiée (figure 20). Nous avons retenu l'espèce rat pour étudier l'expression des PPARa,~ et
de la COX-l humaine, et l'espèce souris pour PPARy, COX-2 et ~-caténine. Les amorces
sens et anti-sens utilisées au cours de la PCR sont identiques entre les couples d'espèces
(rat/homme) ou (souris/homme) et génèrent après amplification des fragments de même
taille. Cependant, la carte de restriction de chacun de ces fragments est différente.
L'utilisation d'une enzyme de restriction spécifique d'un des fragments permet de distinguer
l'amplification rat/homme (ou souris/homme) et donc de connaître les quantités relatives
d'ARNm pour chaque protéine étudiée. Cette valeur n'est cependant valable que si elle est
rapportée à celle d'un marqueur constitutif. Dans notre cas, ce sera le produit d'amplification
des ARNm du gène de la G3PDH. Le rapport des mesures rPPARlrG3PDH (r pour rat)
donne une première estimation correspondant à l'expression relative de PPAR au niveau de
l'intestin de rat. Une mesure identique est réalisée pour les échantillons dont nous voulions
connaître le taux des ARNm de PPAR. Nous obtenons un rapport hPPARlhG3PDH (h pour
humain) qui représente l'expression relative de PPAR au niveau de l'échantillon testé.
La comparaison entre les rapports rPPARlrG3PDH et hPPARlhG3PDH permet de
quantifier l'expression de hPPAR par rapport au compétiteur. Ainsi, l'expression relative de
hPPAR en valeur arbitraire serait: (hPPARlhG3PDH )*(rPPARlrG3PDH).
Cette équation devient (hPPARlrPPAR )*(hG3PDH/rG3PDH) où la valeur hPPAR est
rapportée à celle de rPPAR, cette mesure étant elle-même modulée par l'expression relative
du marqueur constitutif présent dans le système humain et de rat (ou de souris). De cette
manière, il n'est pas nécessaire de connaître la quantité de molécule de départ du
compétiteur. Par contre, son expression relative, rapportée à celle d'un standard interne du
tissu considéré, doit être mesurée.
Les différents couples d'amorces sélectionnées, les enzymes de restriction choisies,
la taille des fragments amplifiés (digérés ou non par l'enzyme de restriction) sont présentés
dans les tableaux 3 et 4.
Ainsi le gène PPARa est étudié par RT-PCR compétitive avec les ARNm
compétiteurs d'intestin de rat. 28 cycles sont nécessaires pour amplifier par PCR les ADNc
obtenus après transcription inverse. La taille du fragment obtenu est de 385 paires de base
(pb). L'enzyme de restriction Eco RI coupe uniquement le fragment de rat digéré pendant 1
heure à 37°C et produit deux fragments de 309 et de 76 pb.
Le gène PPAR~ est étudié par RT-PCR compétitive avec les ARNm compétiteurs
d'intestin de rat. 28 cycles sont nécessaires pour amplifier par PCR les ADNc obtenus après
transcription inverse. La taille du fragment engendré est de 560 pb. L'enzyme de restriction
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