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Etude par RT-PCR Le taux des ARNm des PPAR des cellules Caco-2 à 5, 10 et 15 jours de culture a également été quantifié par une technique de RT-PCR de type compétitif, semi-quantitatif et semi-niché. La technique de RT PCR compétitive que nous avons utilisée a été décrite par Kihri et al. [163]. La technique de RT-PCR nécessite une excellente extraction des ARN qui peut-être vérifiée par électrophorèse en gel d'agarose (figure 30). Cette technique a également été optimisée en terme de concentration de MgCb pour chaque couple d'amorces, mais aussi en ce qui concerne le nombre de cycles. La figure 31 montre la cinétique d'amplification pour chaque PPAR des cellules Caco-2 à 5 et 15 jours de culture ainsi que la cinétique d'amplification des compétiteurs de chaque gène étudié (ARN totaux extraits d'intestin de rat et d'adipocytes de souris). Le nombre de cycles est défini lorsque le signal d'amplification est exponentiel. Les fragments amplifiés sont digérés par plusieurs enzymes de restriction dans le but de vérifier l'absence de concatémères au cours de l'amplification par RT-PCR (figure 32). C'est la raison pour laquelle le produit d'amplification est digéré par une enzyme de restriction possédant un site unique pour chaque espèce. Par exemple, le produit d'amplification de COX-1 est coupé par EcoRI uniquement chez l'humain et Apal coupe uniquement le fragment de rat. La double digestion par EcoRI et Apal d'un produit de coamplification montre une digestion totale. Ce résultat prouve l'absence de concatémères formés au cours de l'utilisation de la technique de RT-PCR. Un résultat typique d'une expérience de RT-PCR compétitive à partir des ARNm extraits des cellules Caco-2 à 5 jours de culture est présenté dans la figure 33. La figure 34 montre le résultat d'amplification pour la ~-caténine et le témoin G3PDH pour les cellules Caco-2 à 5, 10 et 15 jours de culture ainsi que les produits de digestion obtenus avec les enzymes de restriction de chaque amplification. Chaque produit d'amplification est déposé sur gel d'agarose en triple exemplaires. Dans cet exemple, les ARNm de la ~-caténine augmente de 3 fois au cours de la culture. b. Résultats obtenus Mesure du taux des ARNm de PPARa dans les cellules Caco-2 Les ARN totaux et les ARN polyA+ extraits et purifiés respectivement à partir des cellules Caco-2 récupérées à 5, 10 et 15 jours de culture ont permis d'étudier les taux des 83
Caco-2 5 10 15 TA IR --288 -188 Figure 30 : Vérification sur gel d 'agarose de la qualité des ARN totaux extraits. 1IJg d 'ARN totaux extraits à partir des cellules Caco-2 à 5, 10 et 15 jours de culture est déposé sur un gel d 'agarose à 2%. La présence des bandes 288 et 188 correspondants aux ARN ribosomiques indique que l'extraction est de bonne qualité. TA : tissu adipeux de souris; 1R : intestin de rat
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VIII. ROLES DES PPAR DANS CERTAINES
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CARACTERES GENERAUX SUR LE COLON F
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La voie de transduction Wnt/Wingles
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VI. INTERVENTION DES PPAR DANS LA D
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