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. Dosages enzymatiques
Préparation des homogénats cellulaires
Après 5, 10 et 15 jours de culture, les tapis de cellules sont rincés 3 fois en présence
de DPBS froid. Après lavage, les cellules sont grattées puis homogénéisées en présence de
tampon Tris/HCI à 2 mM (pH :7,1) contenant 30 mM de mannitol. La concentration en CaCI 2
de chaque échantillon est ajusté au final à 10 mM. Les échantillons sont laissés 1 heure sur la
glace, puis centrifugés à 4°C pendant 20 min à 1500 g. Après centrifugation, les surnageants
sont recueillis et centrifugés à 4°C pendant 30 min à 15000g. Les culots obtenus sont repris
dans la solution d'homogénéisation et conservés à -80°C jusqu'à leur utilisation. La
concentration en protéines des échantillons est mesurée par la technique de Bradford [24].
Dosage de l'activité de la phosphatase alcaline
L'activité de la phosphatase alcaline (EC 3.13.1) est mesurée d'après la technique
décrite par Garen et Levinthal [98] en utilisant comme substrat le paranitrophénol phosphate.
L'unité enzymatique de l'activité de la phosphatase alcaline est définie par l'activité de
l'enzyme nécessaire à l'hydrolyse de 1 Ilmole de paranitrophénol phosphate par minute à
3TC. Les résultats sont exprimés en mU/mg de protéines.
Dosage de l'activité de la saccharase/isomaltase
L'activité de la saccharase/isomaltase (EC 3.3.1.1) est mesurée d'après la technique
décrite par Messer et Dahlqvist [220]. L'unité enzymatique de la saccharase/isomaltase est
définie par l'activité de l'enzyme nécessaire à l'hydrolyse de 1 Ilmole de saccharose par
minute à 3TC. Les résultats sont exprimés en mU/mg de protéines.
Dosage de l'activité de la catalase
L'activité de la catalase (EC 1.11.1.6) est mesurée d'après la technique décrite par
Baudhuin et al. [15]. Les homogénats cellulaires sont dans ce cas préparés dans du tampon
imidazole/HCI à 20 mM (pH :7,0) contenant 0,1% (p/v) d'albumine bovine sérique, 1 % (p/v) de
Triton X100. L'unité enzymatique de la catalase (unité Baudhuin, UB) est définie par l'activité
de l'enzyme nécessaire à l'hydrolyse de 1 Ilmole de H 2 0 2 en H 2 0 et Y2 O 2 par minute à 37°C,
selon les conditions expérimentales. Les résultats sont exprimés en mUB/mg de protéine.
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