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agitation dans 1°ml d'une solution de saturation préalablement diluée 10 fois dans du tampon
Tris/HCI 50 mM (pH :7,5) contenant 0,15 M NaCI .
La membrane est incubée une nuit à 4°C en présence de l'anticorps primaire ajouté à
la solution de saturation diluée 20 fois avec du tampon Tris/HCI 50 mM (pH :7,5) contenant
0,15 M NaCI. Après incubation, la membrane est lavée 2 fois pendant 1°min en présence de
tampon Tris/HCI 50 mM (pH :7,5) contenant 0,15 M NaCI et 0,1 % (v/v) de Tween 20 et 2 fois
durant 1°min dans une solution de saturation diluée 20 fois avec du tampon Tris/HCI 50 mM
(pH :7,5) contenant 0,15 M NaCI. la membrane est ensuite incubée en présence de l'anticorps
secondaire dilué au 1/2000 dans une solution de saturation diluée 20 fois avec du tampon
Tris/HCI 50 mM (pH :7,5) contenant 0,15 M NaCI, pendant 30 min à température ambiante
sous agitation. Après incubation, la membrane est lavée 4 fois pendant 10 min avec du
tampon Tris/HCI 50 mM (pH :7,5) contenant 0,4 M NaCI et 0,1 % Tween, puis séchée entre 2
feuilles de papier absorbant. le substrat (Iuminol) est déposé sur la membrane. Après 1 min
d'incubation, la membrane est séchée, puis placée dans une cassette au contact d'un film
d'autoradiographie (Film Trimax, 3M, USA). Après révélation, l'intensité des signaux observés
est quantifiée par densitométrie (GeIDoc, Bio Rad).
III. TECHNIQUES HISTOLOGIQUES
a. Immunocytochimie
Immunocytochimie sur coupes de tissus congelés du tractus digestif fœtal humain
Cette technique a été utilisée dans le but de suivre l'expression des PPAR au cours du
développement du tractus digestif fœtal humain. Les antiséra utilisés correspondent aux
anticorps polyclonaux, préparés au laboratoire, dirigés contre chaque isotype de PPAR et
contre les isoformes PPARy1 et ')'2. Le protocole utilisé est schématisé dans la figure 17A.
Des coupes de 5 IJm d'épaisseur sont montées sur des lames Superfrost, puis fixées pendant
45 min à 4°C dans une solution de formaldéhyde à 2 % (p/v) dans du tampon phosphate de
sodium à 1°mM (tampon PBS : 3 mM NaH2P04, 7 mM Na2HP04 (pH :7,4) contenant 0,13 M
NaCI) puis rincées en présence de tampon PBS. Les lames sont ensuite immergées dans le
même tampon PBS contenant 100 mM de glycine pendant 45 min à 4°C, puis rincées à
nouveau avec du tampon PBS.
Les coupes sont préincubées dans une solution saturante contenant 0,1 % (v/v) de
gélatine de poisson, 0,8% (p/v) d'albumine bovine sérique et 0,002% (v/v) de Tween 20
pendant 30 min à température ambiante.
Chaque section est encerclée par un film de silicone, afin de limiter l'écoulement des
solutions d'incubation qui pourait être responsable d'un dessèchement des tissus. Les
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