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o :',['j 0, C;(:(1~-!>~~ RT-PCR Caco-2 (jours de culture) semi-nichée 5 jours 10 jours 15 jours PPAR 12 0,159 ± 0,048 0,638 ± 0,157 0,321 ± 0,077 PPAR y3 0,371 ± 0,099 0,055 ± 0,031 0,470 ± 0,086 RT-PCR HT29 (jours de culture) semi-nichée 5 jours 10 jours 15 jours PPAR 12 0,346 ± 0,183 0,390 ± 0,021 0,160 ± 0,032 PPAR y3 1,213 ± 0,035 0,613 ± 0,044 0,470 ± 0,042 Tableau 10: Quantification des ARNm de PPARy2 et de PPARy3 par RT-PCR semi-nichée au niveau des cellules Caco-2 et HT 29 à 5, 10 et 15jours de culture.
l'activité enzymatique de AOX et celle de la catalase sont présentes dès 5 jours de culture même si les structures DAB-positives ne sont pas détectables à ce stade de culture. Ces résultats sont en accord avec les travaux précédents montrant que les peroxysomes sont absents dans les cellules issues de carcinomes coliques en dépit de la présence de AOX et de la catalase [32, 180]. La différenciation des cellules Caco-2 est accompagnée par une augmentation du nombre des peroxysomes et de l'activité de leurs enzymes. Ces modifications métaboliques ressemblent aux changements observés le long de l'axe cryptovillositaire de l'intestin grêle [32]. De plus, la différenciation des peroxysomes dans les cellules Caco-2 est similaire à celle rencontrée dans les entérocytes humains entre 16 semaines de gestation [61] et l'âge adulte [278]. b. L'expression de PPARa augmente au cours de la différenciation des cellules Caco-2 Dans cette étude, le taux des ARNm de PPARa est étudié par Northern blotting, par protection à la nucléase S1 et par RT-PCR compétitive. Nous avons utilisé plusieurs techniques de quantification des ARNm dans le but de confirmer les résultats obtenus par une seule des techniques citées précédemment. Les études par Northern blotting et par protection à la nucléase S1 sont des techniques dites directes. Les sondes radioactives piègent les ARNm à étudier. Seulement, ces deux techniques nécessitent l'utilisation de radioéléments avec les risques que cela représente pour le manipulateur. Les techniques de RT-PCR sont des techniques de quantification non directes. Cependant, la RT-PCR de type compétitive permet de quantifier le taux des ARNm par rapport à deux témoins internes: le compétiteur et la G3PDH (enzyme étant exprimée d'une façon constitutive). Le taux des ARNm de PPARa et celui de la protéine correspondante augmentent entre 5 et 10 jours de culture, stade précoce de la différenciation cellulaire. La quantité de la protéine PPARa augmente régulièrement bien que le taux des ARNm codant cet isotype reste constant à 15 jours de culture. Les résultats obtenus par immunocytochimie indiquent au début de la culture la présence de PPARa au niveau nucléaire mais également cytoplasmique, de type granulaire et en très faible quantité. L'intensité des signaux augmente avec le processus de différenciation de ces cellules et devient majoritairement cytoplasmique. Parallèlement, nous avons étudié le taux des ARNm et celui de la protéine de PPARa dans les cellules HT29 entre 5 et 15 jours de culture. Ces cellules restent indifférenciées. Les résultats obtenus au niveau des cellules HT29 sont similaires à ceux obtenus pour les cellules Caco-2. Au cours de la culture, le taux des ARMm codant PPARa et celui de la 87
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