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d'une solution de NaOH 0,1 M/EOTA 5 mM, avec 5 ml d'H 2 0 traitée au OEPC et enfin avec 5
ml de tampon Tris/HCI 40 mM (pH :7,4) contenant 1 mM EOTA, 1M NaCI et 0,1% (v/v) SOS.
la colonne est lavée avec 5 ml de tampon Tris/HCI 20 mM (pH :7,4) contenant 1 mM EOTA,
0,2 M NaCI et 0,1 % (v/v) de SOS afin d'éliminer les ARNt et ARNr. Puis 3 ml de tampon Tris/
HCI 10 mM (pH :7,4) contenant 1 mM EOTA et 0,05% (v/v) de SOS sont déposés sur la
colonne afin de récupérer les ARN poly A+. les ARNm contenus dans 300 IJUtube sont
précipités par addition de 1/10 du volume d'acétate de sodium 3 M (pH :4,5) et de 2,5 volumes
d'éthanol 99 % (v/v). les échantillons sont placés à -20°C pendant une nuit. Après
centrifugation à 10000g pendant 20 min à 4°C, les culots contenant les ARN poly A+ sont
lavés deux fois en présence d'éthanol à 70 % (v/v) puis redissous dans une solution d'EOTA à
1 mM. les ARN polyN sont quantifiés au spectrophotomètre à 260 nm.
c. Quantification du taux d'ARNm par la technique de Northern-blotting
Electrophorèse des ARN
l'electrophorèse est réalisée selon la méthode décrite par Thomas [332] : 1°Ilg d'ARN
totaux dissous dans 41ll d'EOTA 1 mM (pH :8,0) sont incubés pendant une heure à 50°C en
présence de 16 III d'une solution de dénaturation comprenant 2 III de tampon phosphate de
sodium à 0,1 M (pH: 6,5), 4 III de glyoxal désionisé à 1M et 1°III de OMSO. Après
incubation, 11ll de tampon de dépôt (phosphate de sodium à 10 mM (pH 6,5) contenant 2,5
mg/ml de xylène cyanol et 2,5 mg/ml de bleu de bromophénol) est ajouté à chaque
échantillon. les marqueurs de taille lambda ONA Bst El/digest (Biolabs, Beverly, MA, USA)
et RNA Molecular Weight marker 1 (Roche) subissent le même traitement.
les échantillons sont déposés sur un gel d'agarose à 1 % (p/v) préparé dans du
tampon phosphate de sodium 10 mM (pH: 6,5). la migration s'effectue dans le même tampon
pendant 4 heures sous un courant continu de 100 volts. Une pompe à recirculation est
branchée 15 min après le début de la migration pour permettre une bonne distribution du
tampon.
Transfert sur Nylon
Après migration, les ARN sont transférés par capillarité sur une membrane de Nylon en
présence de tampon 20X SSC (0,3 M NaCI et 0,03 M citrate trisodique) pendant 18 heures.
Après transfert, la membrane est chauffée à 80°C pendant deux heures. la qualité du transfert
est vérifiée par coloration des standards au bleu de méthylène à 0,04% (p/v) dilué dans une
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