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solution d'acétate de sodium 0,5 M (pH: 6,0). A ce stade, la membrane peut être conservée à
-20°C jusqu'à son utilisation.
Marquage de la sonde
le marquage de la sonde est réalisé selon la technique de marquage aléatoire en
utilisant [a 32 P]-dCTP comme traceur. le marquage est réalisé selon la technique décrite par
Feinberg et Volgelstein [87] grâce à une trousse de marquage (Biosciences, Little Chalfont
Buckinghamshire, Angleterre) : 20 ng de sonde purifiée sont incubés en présence de 5 III
d'amorces. le mélange est dénaturé à 100°C pendant 5 min puis refroidi brutalement dans la
glace. 10 III de tampon de marquage (contenant dATP, dTIP, dGTP), 5 III de [a 32 P]-dCTP
(correspondant à 50 IlCi) et 2 III d'enzyme de Klenow (1 U/~l) sont ajoutés successivement.
le volume du mélange est ramené à 50 III par de l'eau stérile. Après incubation pendant une
heure à 37°C, la sonde marquée est séparée des nucléotides libres par filtration sur gel à
l'aide d'une colonne contenant du Sephadex G50 (Biosciences) préalablement équilibré dans
du tampon Tris/HCI 10 mM (pH :7,4) contenant 1 mM d'EDTA.
Préhybridation et hybridation
la préhybridation s'effectue pendant 18 heures à 42°C à l'aide d'une solution
contenant du tampon phosphate de sodium à 50 mM (pH :6,5), du formamide désionisé à 50%
(v/v) , une solution de Denhardt's 10X (Ficoll à 0,2% (pl v), du polyvinyl pyrolidone à 0,2% (plv),
de la sérum albumine bovine à 0,2% (plv)) et 2,5 mg d'ADN de sperme de saumon soniqué
(Eurobio) dénaturé à 100°C pendant 5 min.
l'hybridation est réalisée pendant 18 heures à 42°C avec la solution de préhybridation
contenant la sonde marquée, préalablement dénaturée à 100°C pendant 5 min en présence
de 2,5 mg d'ADN de sperme de saumon soniqué et 2 volumes d'une solution de sulfate de
dextrane à 50% (plv). Après incubation, la membrane est lavée 4 fois à température ambiante
pendant 5 min avec une solution contenant 2X SSC et 0,1% (v/v) de SDS, puis pendant 15
min à 50°C avec une solution contenant 0,5X SSC et 0,1% SDS (v/v). Cette étape permet
d'éliminer l'excès de sonde non hybridée. la membrane est finalement exposée à un film
radiographique (film Trimax, 3M, USA) et placée à -80°C pendant 5 jours. l'intensité des
bandes a été quantifiée au Phosphorlmager (Molecular Dynamics, USA). les membranes sont
deshybridées, puis hybridées à nouveau en présence d'une sonde ADNe correspondant à un
fragment de l'ADNe de la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (G3PDH, BD
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