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Dans le but d'expliquer comment ces modifications biochimiques sont en relation avec des altérations structurales des cellules Caco-2 en culture, nous avons étudié la présence de la catalase dans les peroxysomes par immunocytochimie ultrastructurale (figure 27). Aucune réaction positive n'est détectée dans les cellules Caco-2 à 5 jours de culture. Un marquage apparaît faiblement au sein de peroxysomes peu nombreux à 10 jours de culture. La fréquence de ces organites augmente entre 10 et 15 jours de culture. Les peroxysomes présentent différents profils: ronds, ovales ou allongés. II. ANALYSE TRADUCTIONNELLE DES PPAR AU COURS DE LA DIFFERENCIATION DES CELLULES Caco-2 a. Choix des techniques Nous avons étudié les taux protéiques des PPAR dans les cellules Caco-2 à 5, 10 et 15 jours de culture par immunoréplique grâce aux anticorps polyclonaux préparés au Laboratoire et dirigés spécifiquement contre les différentes isoformes PPARa, PPARy et PPARy2. La localisation des PPAR au cours de la différenciation spontanée des cellules Caco-2 cultivées pendant 5, 10 et 15 jours est également étudiée par immunocytochimie grâce à ces anticorps polyclonaux anti-PPARa et anti-PPARy préparés au Laboratoire et anti-PPARy provenant du commerce (AB Reagent). Le montage utilisé pour mettre en évidence in situ les PPAR fait appel au complexe streptavidine-biotine (figure 17C). Nous avons utilisé un anticorps secondaire biotinylé dirigé contre l'anticorps primaire puis un complexe streptavidine couplé à la peroxydase. La révélation se fait grâce à une solution commerciale (Novared, BioValley). b. Résultats Expression de PPARa dans les cellules Caco-2 Par immunoréplique, une bande majoritaire de 52 kDa correspondant à PPARa est révélée à partir des homogénats cellulaires. Son intensité augmente de 1,9 fois entre 5 et 15 jours de culture (figure 28A). Par immunocytochimie, quelques noyaux des cellules Caco-2 sont marqués lorsque l'anticorps anti-PPARa préparé au Laboratoire est utilisé (figure 29A-C et tableau 8). Une immunoréactivité est aussi observée dans le cytoplasme. L'intensité du signal augmente à 10 jours, mais elle est plus prononcée à 15 jours de culture. A ce stade, le signal devient majoritairement nucléaire, même si quelques signaux persistent dans le cytoplasme. Aucun signal n'est observé lorsque l'anticorps primaire est remplacé par le sérum préimmun. De 81
Figure 27 : Mise en évidence de l'activité catalasique peroxysomale dans les cellules Caco-2. A : Monocouche de cellules Caco-2 à 10 jours de culture. Les noyaux sont plurilobulaires et les microvillosités sont présentes à l'apex des cellules. B : Mise en évidence des structures DAB-positives dans les cellules Caco-2 à 10 jours de culture. Les peroxysomes sont localisés près des mitochondries. C et D : Présence plus abondante de structures DAB-positives dans les cellules Caco-2 à 15 jours de culture. Les flèches indiquent la présence des peroxysomes. M : mitochondrie; barre 1 IJm (a et c) et 0,5 IJm (b et d).
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