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agitation dans 1°ml d'une solution de saturation préalablement diluée 10 fois dans du tampon Tris/HCI 50 mM (pH :7,5) contenant 0,15 M NaCI . La membrane est incubée une nuit à 4°C en présence de l'anticorps primaire ajouté à la solution de saturation diluée 20 fois avec du tampon Tris/HCI 50 mM (pH :7,5) contenant 0,15 M NaCI. Après incubation, la membrane est lavée 2 fois pendant 1°min en présence de tampon Tris/HCI 50 mM (pH :7,5) contenant 0,15 M NaCI et 0,1 % (v/v) de Tween 20 et 2 fois durant 1°min dans une solution de saturation diluée 20 fois avec du tampon Tris/HCI 50 mM (pH :7,5) contenant 0,15 M NaCI. la membrane est ensuite incubée en présence de l'anticorps secondaire dilué au 1/2000 dans une solution de saturation diluée 20 fois avec du tampon Tris/HCI 50 mM (pH :7,5) contenant 0,15 M NaCI, pendant 30 min à température ambiante sous agitation. Après incubation, la membrane est lavée 4 fois pendant 10 min avec du tampon Tris/HCI 50 mM (pH :7,5) contenant 0,4 M NaCI et 0,1 % Tween, puis séchée entre 2 feuilles de papier absorbant. le substrat (Iuminol) est déposé sur la membrane. Après 1 min d'incubation, la membrane est séchée, puis placée dans une cassette au contact d'un film d'autoradiographie (Film Trimax, 3M, USA). Après révélation, l'intensité des signaux observés est quantifiée par densitométrie (GeIDoc, Bio Rad). III. TECHNIQUES HISTOLOGIQUES a. Immunocytochimie Immunocytochimie sur coupes de tissus congelés du tractus digestif fœtal humain Cette technique a été utilisée dans le but de suivre l'expression des PPAR au cours du développement du tractus digestif fœtal humain. Les antiséra utilisés correspondent aux anticorps polyclonaux, préparés au laboratoire, dirigés contre chaque isotype de PPAR et contre les isoformes PPARy1 et ')'2. Le protocole utilisé est schématisé dans la figure 17A. Des coupes de 5 IJm d'épaisseur sont montées sur des lames Superfrost, puis fixées pendant 45 min à 4°C dans une solution de formaldéhyde à 2 % (p/v) dans du tampon phosphate de sodium à 1°mM (tampon PBS : 3 mM NaH2P04, 7 mM Na2HP04 (pH :7,4) contenant 0,13 M NaCI) puis rincées en présence de tampon PBS. Les lames sont ensuite immergées dans le même tampon PBS contenant 100 mM de glycine pendant 45 min à 4°C, puis rincées à nouveau avec du tampon PBS. Les coupes sont préincubées dans une solution saturante contenant 0,1 % (v/v) de gélatine de poisson, 0,8% (p/v) d'albumine bovine sérique et 0,002% (v/v) de Tween 20 pendant 30 min à température ambiante. Chaque section est encerclée par un film de silicone, afin de limiter l'écoulement des solutions d'incubation qui pourait être responsable d'un dessèchement des tissus. Les 55
MONTAGES LEGENDES • • antigènes l Anticorps primaire l Anticorps secondaireibiotine @ ~ • ;> • ~ Steptavidine/peroxydase r Anticorps secondairel FITC ! Anticorps anti·FITCI phosphatase alcaline 0 l;)~ "l'~ i':) MAnticorps secondairel polymère de i':)e Dextranl peroxydase Figure 17: Description des différentes procédures utilisées en immunocytochimie A) le complexe antigène/anticorps primaire est mis en évidence grâce à un anticorps secondaire couplé à la fluorescéine (chèvre anti- IgG de lapin/FITC). B) le complexe antigène/anticorps primaire est mis en évidence grâce à un anticorps secondaire couplé à la fluorescéine (chèvre anti· IgG de lapîn/FITC) auquel est ajouté un anticorps tertiaire dirigé contre la fluorescéine couplée à la phosphatase alcaline. L'ensemble est révélé grâce à une trousse commerciale Fast Red. e) le complexe antigène/anticorps primaire est mis en évidence grâce à un anticorps secondaire couplé à la biotine (chèvre anti- IgG de lapin/biotine) auquel est ajouté un complexe streptavidine peroxydase. L'ensemble est révélé par la DAB. 0) Le complexe antigène/anticorps est mis en évidence grâce à un anticorps secondaire couplé à un polymère de Dextrane lui-même conjugué à la peroxydase. La révélation se fait grâce à une solution commerciale NovaRed.
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CARACTERES GENERAUX SUR LE COLON F
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Peroxisome proliferator-activated r
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