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MATERIELS ET METHODES
1. MODELES BIOLOGIQUES
a. Lignées cellulaires
les cellules Caco-2 [93] sont cultivées dans du milieu minimum essentiel modifié par
Dulbecco (DMEM ; Eurobio, les Ulis, France) contenant 20 % (v/v), de sérum de veau foetal
(Life Technologies, Paysley, Ecosse) décomplémenté par chauffage à 56°C pendant 30 min et
1 % (v/v) d'acides aminés non essentiels (Eurobio). les cellules HT29 [93] sont cultivées dans
du milieu DMEM contenant 10 % (v/v) de sérum de veau foetal (Eurobio) décomplémenté et 2
mM de l-glutamine (Eurobio). les flacons de culture sont placés dans un incubateur (Heraeus,
Mannheim, Allemagne) à 37°C sous une atmosphère humide contenant 5 % de CO 2
. le milieu
de culture est changé tous les jours.
les cellules Caco-2 et HT29 sont repiquées (cette opération est appelée Passage et
est notée Pi), respectivement à 5 et 7 jours de culture. le tapis cellulaire est lavé avec du
tampon phosphate de sodium/potassium modifié par Dulbecco (DPBS : 8 mM Na2HP04, 7
H20, 1,5 mM KH2P04 (pH :7,4) contenant 1,37 mM NaCI et 2,7 mM KCI) puis dissocié par un
mélange de trypsine à 2 % (p/v) et d'EDTA à 0,54 mM (Eurobio) préalablement chauffé à
37°C. Après 5 min d'incubation, la suspension cellulaire obtenue est mélangée à 5 ml de
milieu de culture puis elle est centrifugée à 1000 g pendant 5 min. le culot de cellules obtenu
est finalement suspendu dans du DPBS. le nombre des cellules est apprécié à l'aide d'un
hématimètre Neubauer après dilution au demi dans une solution de bleu trypan à 0,04 % (v/v).
les cellules Caco-2 et HT29 sont ensemencées à raison de 6.10 4 cellules/ml et 5.10 5
cellules/ml de milieu de culture, respectivement. les cellules sont placées à 37°C sous une
atmosphère humide contenant 5 % de C02. Il est important de préciser qu'au cours de cette
étude, nous avons utilisé des cellules Caco-2 correspondant à des passages compris entre
P106 et P120. En effet, lors des repiquages successifs, l'expression des marqueurs de
différenciation de ces cellules comme la saccharase/isomaltase peut diminuer ou disparaître
[388]. Concernant les cellules HT29, nous avons utilisé les passages compris entre P190 et
P205.
les cellules sont recueillies après 5, 10 et 15 jours de culture. le tapis de cellules est
lavé trois fois avec du DPBS froid puis est stocké à -80°C jusqu'à utilisation.
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