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puis retourné à l'aide d'une fine baguette de verre de 2 mm de diamètre. Une extrémité de
l'intestin est ligaturée tandis que l'autre est laissée libre afin de pouvoir remplir doucement
l'intestin de tampon DPBS à l'aide d'une seringue sans aiguille. L'intestin ainsi gonflé est
déposé dans un erlenMeyer rempli de 100 mL d'une solution contenant 0,15 M NaCI et 1 mM
d'EDTA (pH :S,O). L'ensemble mis sur de la glace pendant 10 min est agité régulièrement. Les
entérocytes sont mis en suspension sous l'action de l'EDTA.
L'enrichissement et la qualité de chaque fraction cellulaire sont apprecles sous
microscope à phase inversée. Les premières fractions sont riches en entérocytes provenant
du haut des villosités (fractions notées F1). Les fractions suivantes (F2 à F4) sont constituées
de cellules de la partie médiane, puis de la base des villosités. Les dernières fractions (F5 et
F6) contiennent les cellules des cryptes. Chaque fraction est centrifugée pendant 5 min à 3000
g. Les culots cellulaires reçoivent 2 mL d'une solution d'extraction des ARN puis sont placés à
-SO°C.
Il.TECHNIQUES BIOCHIMIQUES
a. Dosage des protéines
Extraction protéique
Les protéines sont extraites à partir des cellules Caco-2, des cellules HT29, des
tissus humains et murins selon le protocole décrit par Mansen et al. [210].
100 mg de tissus sont homogénéisés au Potter dans 500 ~L de la solution d'extraction
protéique contenant 25 mM Hepes/KOH (pH :7,5), 0,4 M KCI, 1 mM EDTA, 2 mM DTT et un
mélange d'anti-protéases (complexe BM , Roche, Mannheim, Allemagne). Les cellules Caco-2
ou les cellules HT29 sont récupérées à l'aide d'un rateau et sont rassemblées dans 500 ~L de
la solution d'extraction. L'ensemble est vortexé puis laissé à 4°C pendant 15 min. Après
centrifugation à 15000 g pendant 20 min à 4°C, seul le surnageant est conservé.
Oosage protéique
Les protéines totales sont dosées par la technique de Bradford [24] grâce à une
trousse commerciale (Bio Rad, Hercules, CA, USA). Nous avons utilisé l'albumine bovine
sérique (B8A) comme protéine de référence.
Les protéines sont conservées à -SO°C sous forme d'aliquotes de 50 ~g, 25 ~g ou 10 ~g de
protéines.
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