Ce document numérisé est le fruit d'un long travail approuvé par le ...
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La révélation des comp<strong>le</strong>xes antigène-anticorps formés <strong>est</strong> réalisée grâce au<br />
montage décrit précédemment (Figure 17C). Nous avons utilisé un anticorps secondaire<br />
anti-lgG de lapin produit chez <strong>le</strong> porc et conjugué à la fluorescéine (dilution 1/100 ; porc anti<br />
IgG de lapin/FITC, Jackson) et un anticorps tertiaire dirigé contre la fluorescéine (dilution<br />
1/2000 ; chèvre anti-FITC de porc, Jackson). La révélation <strong>est</strong> réalisée à l'aide <strong>d'un</strong>e solution<br />
Fast-Red (Sigma).<br />
• Mise en évidence de la protéine cytochrome c<br />
Les coupes sont dé<strong>par</strong>affinées dans 3 bains successifs de toluène pur, réhydratées<br />
<strong>par</strong> passage dans des bains d'alcool de concentration décroissante puis dans de l'eau. Un<br />
pré-traitement des coupes visant à inverser la fixation formolée <strong>est</strong> effectué. <strong>Ce</strong> traitement<br />
<strong>est</strong> réalisé <strong>par</strong> chauffage. Les lames sont p<strong>long</strong>ées dans une solution d'EOTA 100 mM<br />
(pH :8,0) et chauffées dans un four à micro-ondes (Micromed TT, Microm, Franchevil<strong>le</strong>,<br />
France) pendant 1h à 98°C, puis el<strong>le</strong>s sont directement refroidies dans l'eau. Un film de<br />
silicone <strong>est</strong> déposé autour de chaque section. Les lames sont immergées dans du tampon<br />
PBS. L'anticorps primaire dilué au 1/200 <strong>est</strong> déposé sur chaque coupe, pendant une nuit<br />
dans une chambre humide et à 4°C. Les lames sont rincées au PBS- Tween. Un anticorps<br />
secondaire couplé à un polymère de Oextrane lui-même conjugué à la peroxydase ( trousse<br />
commercia<strong>le</strong> PowerVision, immunoVision Technologies) <strong>est</strong> déposé pendant 1 heure (figure<br />
170), d'après <strong>le</strong>s instructions du fournisseur. La révélation se fait grâce à une solution<br />
commercia<strong>le</strong> (NovaRed, BioVal<strong>le</strong>y, Burlingame, CA).<br />
• Mise en évidence des protéines cytokératine 18 et de Ki67<br />
Les coupes sont dé<strong>par</strong>affinées dans 3 bains successifs de toluène pur, réhydratées<br />
<strong>par</strong> passage dans des bains d'alcool de concentration décroissante puis dans de l'eau. Un<br />
pré-traitement des coupes <strong>est</strong> réalisé <strong>par</strong> chauffage. Les lames sont p<strong>long</strong>ées dans une<br />
solution d'EDTA à 100 mM (pH: 8,0) et chauffées dans un four à micro-ondes de laboratoire<br />
(Micromed) pendant 1h à 98°C, puis el<strong>le</strong>s sont imédiatement refroidies dans l'eau. Un film de<br />
silicone <strong>est</strong> déposé autour de chaque section. Les lames sont immergées dans du tampon<br />
PBS. L'anticorps primaire anti-cytokératine 18 dilué au 1/200 ou l'anticorps primaire anti-Ki67<br />
dilué au 1/200 <strong>est</strong> déposé sur chaque coupe, pendant une nuit dans une chambre humide et<br />
à 4°C. Les lames sont rincées au PBS-Tween. La révélation du comp<strong>le</strong>xe antigène-anticorps<br />
fait appel au montage décrit précédemment (figure 17B). Nous avons utilisé un anticorps<br />
secondaire biotinylé (dilution 1/200) dirigé contre l'anticorps primaire puis un conjugué<br />
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