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Biosciences Clontech, NJ, USA) selon le protocole décrit précédemment. La G3POH est utilisée comme témoin interne dans nos expériences. Le taux transcriptionnel de PPAR est rapporté à celui de la G3PDH. d. Quantification du taux d'ARNm par la technique de protection à la nucléase 81 La technique de protection à la nucléase S1 [287] permet de quantifier le taux d'ARNm d'un gène particulier. Nous avons utilisé cette technique pour quantifier les taux d'ARNm de PPARa, 12 et y3. Des sondes ADN spécifiques de chaque isoforme de PPAR sont marquées radioactivement et mises en présence d'extraits d'ARN totaux (Figure 18). Les complexes ARN/ADN marqués se forment. La nucléase S1 élimine les brins d'ARN non hybridé à la sonde ainsi que la sonde en excès. Les hybrides formés sont déposés sur un gel d'acrylamide/bis acrylamide dans des conditions dénaturantes. Après migration, le gel est exposé contre un film radiographique. Les signaux obtenus sont quantifiés. Production de sondes ADNc spécifiques de chaque isoforme de PPAR Le taux d'ARNm codant les PPAR a nécessité la production de sondes ADNc spécifiques de chaque isotype de PPAR. Ces sondes sont obtenues selon un protocole classique de RT-PCR. 51-1g d'ARN totaux extraits des cellules Caco-2 ou de tissu adipeux humain sont transcrits en AONc par l'enzyme M-MLV (Invitrogen, Paisley, Ecosse). Les ADNc sont synthétisés dans un volume de 20 1-11 contenant 1 /lg d'ARN, 0,5 mM de chacun des désoxynucléotides triphosphates (Invitrogen), 0,02 g/L d'hexaprimers (amorces aléatoires, Invitrogen), 5 mM de OTT, 5 unités de RNAsine (Invitrogen) et 200 unités de transcriptase inverse M-MLV (Invitrogen) dans du tampon Tris/HCI à 50 mM (pH :8,3) contenant 75 mM KCI et 3 mM MgCI2. Le mélange est incubé à 37°C pendant 2 heures. 2/lL du produit de RT préalablement chauffé à 94°C pendant 30 secondes, sont ajoutés au mélange PCR composé de tampon Tris/HCI 20 mM (pH=8,3) contenant 50 mM KCI, 0,2 /lM de chacun des desoxynucléotides triphosphates (Invitrogen), 0,4 /lM d'amorce sens et antisens du gène étudié, 1,5 mM de MgCI2 et 2,5 unités de Taq Polymerase (Invitrogen). Le volume final de la réaction est de 50I-lL. L'amplification par PCR est réalisée en 30 cycles (95°C, 30s ; 60°C, 30s ; 72°C, 30s) suivis d'une élongation terminale de 5 min à 72°C. Les amorces sens et antisens utilisées 64
ARN Sondes radioactives / hybridation 1111111. L + nucléase S1 Digestion par l'enzyme 1111111. ~ Analyse des hybrides formés sur gel de séquençage marqueurs de taille sondes marquées seules analyse des hybrides formés - - Figure 18 : Représentation schématique de la technique de la protection à la nucléase S1 Dans cette technique, une sonde ADNc marquée au [(X. 32 p]-dCTP s'hybride avec un ARN selon la complémentarité des bases. L'enzyme nucléase 81 digère les ARN non hybridés ainsi que la sonde marquée en excès. Les complexes formés sont analysés sur gel en conditions dénaturantes puis quantifiés.
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VIII. ROLES DES PPAR DANS CERTAINES
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EXPRESSION DES PPAR AU NIVEAU DE LA
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CARACTERES GENERAUX SUR LE COLON F
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Se SEMAINE COUPE SAGnTAtB /' Ile SE
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La voie de transduction Wnt/Wingles
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LES RECEPTEURS ACTIVES PAR LES PROL
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III. DISTRIBUTION TISSULAIRE DES PP
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