Ce document numérisé est le fruit d'un long travail approuvé par le ...

les cellules Caco-2 sont lysées en présence de 2 à 5 ml de solution de travail. Puis
0,1 volume d'acétate de sodium 2 M (pH: 4,0), 1 volume de phénol saturé en eau, 0,2 volume
de chloroforme/alcool isoamylique (49:1) (v/v) sont ajoutés successivement au mélange. Après
agitation pendant 15 secondes à l'aide d'un vortex, le mélange est laissé pendant 15 min à
4°C, puis il est centrifugé à 4°C pendant 20 min à 10000 g. la phase aqueuse est reprise et
mélangée à 2,5 volumes d'éthanol à 99% (v/v) conservé à -20°C pendant 1 heure. Après
incubation, le mélange est centrifugé à 10000 g pendant 1 heure à 4°C. le culot est repris
dans 300 !Jl de solution de travail et précipité par 1 ml d'éthanol 99 % (v/v). les échantillons
sont placés à -20°C pendant 1 nuit. Après centrifugation à 10000 g à 4°C pendant 20 min, le
culot contenant les ARN totaux est lavé en présence de 1 ml d'éthanol à 70 % (v/v) et
centrifugé à SOOO g pendant 10 min à 4°C. le culot d'ARN est séché sous vide pendant 5 min
puis solubilisé dans une solution d'EDTA à 1 mM (pH :S,O) préalablement traité au DEPC.
l'extraction des ARN totaux des cellules HT29 est réalisée selon le même protocole.
les tissus humains et murins conservés à -SO°C sont réduits en poudre dans un Potter
en porcelaine contenant de l'azote liquide. la poudre obtenue est déposée dans un tube
contenant la solution d'extraction des ARN à raison de 1 ml de solution d'extraction pour 100
mg de poudre de tissu. le mélange est vortexé et placé sur de la glace pendant 15 min.
l'extraction des ARN totaux est réalisée selon le protocole décrit précédemment.
les ARN sont quantifiés au spectrophotomètre à 260 nm sachant qu'une unité de DO
correspond à 40 !Jg/ml d'ARN. la qualité des ARN extraits est analysée par électrophorèse
sur gel d'agarose à 2% (p/v) dans du tampon Tris/HCI 90 mM (pH :S,O) contenant 90 mM de
borate de sodium, 2 mM d'EDTA (TBE) et 0,5 flg/ml de bromure d'éthidium. 1 fl9 d'ARN est
déposé par logette. la migration est réalisée à 100 V pendant 30 min. Après migration, les
ARN sont visualisés sous lampe UV. l'aspect des ARN est observé; ne sont conservés que
les échantillons dont les ARN ne sont pas dégradés. les ARN totaux sont aliquotés en 1, 5 ou
10 !Jg et sont conservés à -SO°C.
b. Extraction des ARN polyadénylés
les ARN polyadénylés ou polyA+ sont obtenus par chromatographie d'affinité sur
oligo(dT) cellulose (Sigma) à partir des ARN totaux selon la méthode décrite par Aviv et leder
[S].
1 mg/500 !JI d'ARN totaux est incubé à 65 oC pendant 5 min. Parallèlement, le même
volume de tampon, Tris/ HCI 40 mM (pH :7,4) contenant 1 mM EDTA, 1 M NaCI et 0,1% (v/v)
de SOS est chauffé à 65°C pendant 5 min. le tampon est mélangé à l'échantillon puis laissé à
température ambiante pendant 2 min. l'ensemble est déposé deux fois sur la colonne
d'affinité d'oligo (dT) cellulose préalablement équilibrée par 3 passages successifs de 3 ml
61