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Etude par RT-PCR
Le taux des ARNm des PPAR des cellules Caco-2 à 5, 10 et 15 jours de culture a
également été quantifié par une technique de RT-PCR de type compétitif, semi-quantitatif et
semi-niché. La technique de RT PCR compétitive que nous avons utilisée a été décrite par
Kihri et al. [163].
La technique de RT-PCR nécessite une excellente extraction des ARN qui peut-être
vérifiée par électrophorèse en gel d'agarose (figure 30). Cette technique a également été
optimisée en terme de concentration de MgCb pour chaque couple d'amorces, mais aussi en
ce qui concerne le nombre de cycles. La figure 31 montre la cinétique d'amplification pour
chaque PPAR des cellules Caco-2 à 5 et 15 jours de culture ainsi que la cinétique
d'amplification des compétiteurs de chaque gène étudié (ARN totaux extraits d'intestin de rat
et d'adipocytes de souris). Le nombre de cycles est défini lorsque le signal d'amplification est
exponentiel.
Les fragments amplifiés sont digérés par plusieurs enzymes de restriction dans le but
de vérifier l'absence de concatémères au cours de l'amplification par RT-PCR (figure 32).
C'est la raison pour laquelle le produit d'amplification est digéré par une enzyme de
restriction possédant un site unique pour chaque espèce. Par exemple, le produit
d'amplification de COX-1 est coupé par EcoRI uniquement chez l'humain et Apal coupe
uniquement le fragment de rat. La double digestion par EcoRI et Apal d'un produit de coamplification
montre une digestion totale. Ce résultat prouve l'absence de concatémères
formés au cours de l'utilisation de la technique de RT-PCR.
Un résultat typique d'une expérience de RT-PCR compétitive à partir des ARNm
extraits des cellules Caco-2 à 5 jours de culture est présenté dans la figure 33. La figure 34
montre le résultat d'amplification pour la ~-caténine et le témoin G3PDH pour les cellules
Caco-2 à 5, 10 et 15 jours de culture ainsi que les produits de digestion obtenus avec les
enzymes de restriction de chaque amplification. Chaque produit d'amplification est déposé
sur gel d'agarose en triple exemplaires. Dans cet exemple, les ARNm de la ~-caténine
augmente de 3 fois au cours de la culture.
b. Résultats obtenus
Mesure du taux des ARNm de PPARa dans les cellules Caco-2
Les ARN totaux et les ARN polyA+ extraits et purifiés respectivement à partir des
cellules Caco-2 récupérées à 5, 10 et 15 jours de culture ont permis d'étudier les taux des
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