Alberto Risueño Pérez - Gredos - Universidad de Salamanca

Introducción general
caciones, las sondas están ubicadas a lo largo de toda la secuencia de cada locus génico, siendo
la señal de expresión más fiable y siendo además posible la detección de los distintos exones
del gen (ver figura 5).
El proceso de hibridación para
los modelos 3’ IVT comienza con
el paso de transformación a
cDNA de la muestra de RNA
extraído del tejido o células
sometidas a estudio. Tras este
paso las muestras pueden ser
almacenadas largo tiempo ya
que la molécula de DNA es
mucho más estable que la de
RNA. Cuando llega la hora de
hibridar el microarray el cDNA
se convierte de nuevo a RNA
mediante transcripción in vitro
en el que el RNA es amplificado
Figura 5. Diferencias en la localización de sondas en un locus génico
para los distintos modelos de arrays. (Fuente: www.affymetrix.com)
y etiquetado con biotina fluorescente. Este segundo RNA será la cadena complementaria del
RNA original de la muestra (cRNA). Posteriormente este RNA es fragmentado en cadenas más
cortas similares a los oligonucleótidos del array y es introducido en el dispositivo para lograr la
hibridación. Tras un tiempo de incubación, se procede al lavado de la muestra permaneciendo
exclusivamente el RNA de la muestra marcado con fluorescencia que ha hibridado, es decir, se
ha unido con su sonda complementaria (ver figura 6). Tras un escáner, un láser detecta la
cantidad de fluorescencia para cada celda generando una imagen. Un posterior análisis de esa
imagen cuantifica el nivel de expresión de cada sonda identificándola por su posición concreta
en los ejes X e Y de la matriz y volcando toda la información a un fichero. Estos ficheros son los
denominados "datos crudos". En el caso de los modelos WT, existe un paso intermedio entre la
transcripción in vitro del cRNA y su introducción en el microarray. Este paso consiste en volver
a obtener la hebra del RNA inicial en pequeños fragmentos al azar siguiendo la técnica random
priming. Al existir un paso más, en este caso los oligos no tendrán la secuencia del gen original
sino que deben tener la secuencia complementaria para que se produzca la hibridación (ver
figura 7).
Figura 6. Protocolo de preparación mRNA
extraído (cadenas poliA) para medir la
expresión génica global usando
microarrays: (i) copia por transcripción
reversa a cDNA, (ii) transcripción a cRNA y
etiquetado con sistema biotina, (iii)
fragmentación, (iv) hibridación en
dispositivos microarrays de alta densidad
de oligonucleótidos que miden la
expresión global (genome-­‐wide),
manufacturados por Affymetrix.
(Fuente: www.affymetrix.com)
7