Alberto Risueño Pérez - Gredos - Universidad de Salamanca

Tesis Doctoral
permitiría, sin duda, estudiar de modo más directo y específico las distintas isoformas
proteicas que de dicho locus pueden surgir en distintos tipos celulares o en distintos estados
funcionales.
3.1.2 Técnicas de detección de splicing alternativo
La detección de eventos de splicing se puede realizar mediante técnicas de biología molecular
como es la PCR en tiempo real (RT-­‐PCR). También la información acumulada en bases de datos
biológicas como en librerías de EST u otras como ASD (Thanaraj et al., 2004) o ASTD (Koscielny
et al., 2009), pueden proporcionar pistas sobre la transcripción de isoformas en distintos tipos
de tejidos sanos y también en tejidos enfermos o estados patológicos. Sin embargo, para
obtener una visión global a nivel genómico/transcriptómico en un solo análisis, se precisa el
uso de técnicas de alto rendimiento de gran escala (técnicas "ómicas").
Como se ha explicado en el capítulo 1, los microarrays basados en tecnología de amplificación
3’ IVT, solo incluyen sondas en regiones cercanas al 3’ del locus. No en todos los loci estas
sondas se sitúan en el último exón, pudiendo encontrarse también en exones anteriores o
incluso entre dos exones (sondas inter-­‐exónicas). Algunos autores han aprovechado estos
hechos para inferir eventos de splicing alternativo en determinados genes (Stalteri and
Harrison, 2007) o incluso diseñar alguna herramienta de predicción (Rambaldi et al., 2007).
Sin embargo, estos microarrays no tienen una buena cobertura de todos los exones de los
genes que mapean. Existen por otro lado microarrays diseñados para el estudio del splicing
alternativo que ubican sus sondas entre exones, llamados "exon junction microarrays" (EJM).
Este tipo de tecnología ha sido quizás la más utilizada para estudios de splicing antes de la
llegada de los microarrays específicos de exones y de la secuenciación masiva, y ha dado
buenos resultados según reportan algunas publicaciones (Anton et al., 2008; Johnson et al.,
2003). Incluso más recientemente se han seguido diseñando y comercializando nuevos
modelos de este tipo de microarrays, así como haciendo esfuerzos por plantear estrategias
para su análisis, como es el caso de los métodos computacionales GenASAP (Shai et al., 2006)
o MADS+ (Shen et al., 2010). Con la llegada de la técnica random priming para la copia y
amplificación de material genético, se hizo posible situar sondas a lo largo de un locus génico
de modo uniforme sin sufrir la pérdida de señal que provocaba la lejanía al 3’ con las técnicas
clásicas. De esta manera se pudieron diseñar modelos de microarrays como el Human Exon 1.0
de Affymetrix. Este microarray permite medir no solo la expresión del gen, sino también la
expresión de cada uno de sus exones (ver capítulo 1). Esta forma de poder medir la expresión
a dos niveles (exón y locus completo) constituye la base de todos los algoritmos de medida de
splicing que se detallan en la sección "Materiales y métodos". Este sistema ofrece además la
ventaja de no depender del conocimiento que se tenga de los distintos exones que componen
el genoma en el momento del diseño del microarray, como ocurre en el caso de los EJA (Clark
et al., 2007). El diseño de sondas para todos los exones permite reagrupar las sondas en
transcritos alternativos que pueden cambiar conforme avanza el conocimiento de un locus,
permitiendo así descubrir isoformas no anotadas en el momento del diseño del microarray. La
secuenciación masiva de RNA (RNA-­‐seq) es capaz de identificar y cuantificar las secuencias de
regiones genómicas expresadas en una determinada muestra, a partir de su mRNA total,
independientemente de que dichas regiones estén definidas como un exón (Mortazavi et al.,
2008; Wang et al., 2009). El posterior alineamiento de estas secuencias sobre el genoma,
revela todos los exones que son transcritos para cada gen, lo cual permite la identificación de
eventos de splicing mediante la comparación entre muestras.
El trabajo previo con GATExplorer, presentado en el capítulo 1, proporcionó un mapeo de las
60