Alberto Risueño Pérez - Gredos - Universidad de Salamanca

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Tesis Doctoral los genes encontrados para diferenciar las distintas categorías se comprobó mediante métodos de agrupamiento jerárquicos representados como heatmaps. Para realizar un análisis más detallado de la firma génica significativa y ver si esta permitía discernir y separar bien las distintas categorías en base a sus semejanzas y diferencias de expresión, se utilizó un análisis de componentes principales (PCA). Basados en el resultado de este análisis se realiza una representación tridimensional de las muestras sobre los valores de las tres primeras componentes proporcionadas por el PCA a partir de la matriz de expresión normalizada. Dicha matriz de expresión fue filtrada previamente eliminando el 25% de los genes que menos variaban su expresión (calculado con el rango intercuartil, IQR) para permitir reducir ruido al eliminar genes no informativos. A continuación se calcula la mediana de la expresión de cada gen por cada una de las categorías y se introducen estos valores en la siguiente fórmula: 50 Y ij = X ij − median(ik) sd(ik) + β + median(ik) Esta fórmula fue diseñada para calcular los valores de expresión por gen y muestra considerando su variabilidad dentro de su categoría; siendo Yij la matriz de expresión utilizada para el PCA, Xij la matriz de expresión original, i el gen, j la muestra, k la categoría y β una constante positiva con valor 2, añadida al denominador para asegurar que la varianza de Yij es independiente de la desviación estándar de los genes. Esta fórmula representa una estrategia eficaz para calcular la dispersión de las muestras, réplicas biológicas, basada en su mediana en cada categoría. De esta forma se pueden representar las diferencias entre categorías atenuando la variación entre muestras individuales. El cálculo del PCA se realizó mediante la función prcomp del paquete stats (R_Development_Core_Team, 2010) y la representación visual del mismo mediante el paquete rgl (Alder and Murdoch, 2011), ambos de R. Por último, para el grupo de validación se realizó una selección de las muestras de CLL que marcan de modo más coherente las categorías CLL 13q-‐H y CLL 13q-‐L aplicando un algoritmo de análisis de respuesta (outcome) denominado Global Test que se describe en el siguiente apartado. 2.2.2. Muestras de Mieloma Múltiple y métodos aplicados Los análisis sobre MM se realizan sobre un conjunto de muestras de médula ósea tomadas de 60 pacientes y de 5 controles sanos (obtenidas por el grupo de Hematología del Hospital Clínico Universitario de Salamanca). Alteraciones citogenéticas Número de muestras MM t(4;14) 17 MM t(11;14) 11 MM t(14;16) 4 MM delRB (con deleción de RB) 14 MM delRBp53 (deleción RB y TP53) 1 MM con FISH normal 13 Células plasmáticas sanas (control) 5 TOTAL 65 Tabla 2.2. Características citogenéticas de 60 pacientes diagnosticados con MM incluyendo 5 muestras de células sanas como controles. En estas muestras se aislaron las células plasmáticas utilizando el marcador CD138+ mediante
Capítulo 2 el sistema AutoMACs automated separation system (Milteyi-‐Biotec, Auburn CA, USA) elevando la pureza por encima del 90%. La clasificación de los pacientes se hizo en función de las aberraciones cromosómicas, obteniendo seis subtipos de MM que representan las alteraciones citogenéticas y deleciones más recurrentes en esta enfermedad (ver tabla 2.2). MM subtipo t(4;14) t(11;14) t(14;16) delRB miRNAs alterados Localización cromosómica hsa-‐miR-‐203 14q32 hsa-‐miR-‐155 21q21 hsa-‐miR-‐650 22q11 hsa-‐miR-‐375 2q35 hsa-‐miR-‐196b 7p15 hsa-‐miR-‐342 14q32 hsa-‐miR-‐214 1q24 hsa-‐miR-‐193a 17q11 hsa-‐miR-‐135b 1q32 hsa-‐miR-‐146a 5q33 hsa-‐miR-‐133b 6p12 hsa-‐miR-‐650 22q11 hsa-‐miR-‐125a 19q13 hsa-‐miR-‐375 2q35 hsa-‐miR-‐184 15q25 hsa-‐miR-‐214 1q24 hsa-‐miR-‐95 4p16 hsa-‐miR-‐199a 19p13 hsa-‐miR-‐1 18q11 hsa-‐miR-‐449 5q11 hsa-‐miR-‐133a 18q11 hsa-‐miR-‐196b 7p15 hsa-‐miR-‐135b 1q32 hsa-‐miR-‐214 1q24 hsa-‐miR-‐375 2q35 hsa-‐miR-‐642 19q13 hsa-‐miR-‐196a 17q21 hsa-‐miR-‐486 8p11 hsa-‐miR-‐375 2q35 hsa-‐miR-‐501 Xp11 hsa-‐miR-‐320 8p21 hsa-‐miR-‐20a 13q31 hsa-‐miR-‐133b 6p12 hsa-‐miR-‐135b 1q32 hsa-‐miR-‐126 9q34 hsa-‐miR-‐650 22q11 hsa-‐miR-‐214 1q24 hsa-‐miR-‐19b 13q31 hsa-‐miR-‐10a (Continuación tabla) 17q21 hsa-‐miR-‐15a 13q14 hsa-‐miR-‐133a 18q11 hsa-‐miR-‐139 11q13 hsa-‐miR-‐197 1p13 hsa-‐miR-‐10b 2q31 hsa-‐miR-‐95 4p16 hsa-‐miR-‐126 9q34 hsa-‐miR-‐186 1p31 hsa-‐miR-‐19a 13q31 hsa-‐miR-‐451 17q11 hsa-‐let-‐7b 22q13 hsa-‐miR-‐140 16q22 hsa-‐miR-‐125a 19q13 hsa-‐miR-‐362 Xp11 hsa-‐miR-‐33 22q13 hsa-‐miR-‐223 Xq12 hsa-‐miR-‐224 Xq28 hsa-‐miR-‐221 Xp11 hsa-‐miR-‐30e 1p34 hsa-‐miR-‐374 Xq13 hsa-‐let-‐7c 21q21 hsa-‐miR-‐99b 19q13 hsa-‐miR-‐130a 11q12 hsa-‐miR-‐193a FISH normal 17q11 hsa-‐miR-‐135b 1q32 hsa-‐miR-‐375 2q35 hsa-‐miR-‐155 21q21 hsa-‐miR-‐650 22q11 hsa-‐miR-‐572 4p15 hsa-‐miR-‐152 17q21 hsa-‐miR-‐362 Xp11 hsa-‐miR-‐486 8p11 hsa-‐miR-‐95 4p16 hsa-‐miR-‐214 1q24 hsa-‐miR-‐501 Xp11 hsa-‐miR-‐196a 17q21 hsa-‐miR-‐642 19q13 hsa-‐miR-‐10a 17q21 hsa-‐miR-‐452 Xq28 hsa-‐miR-‐342 14q32 hsa-‐let-‐7c 21q21 hsa-‐miR-‐203 14q32 Tabla 2.3. Listado de los miRNAs cuya expresión ha sido encontrada significativamente desregulada en distintos subtipos de MM: t(4;14), t(11;14), t(14;16), delRB y FISH normal. Tras la obtención y purificación de muestras se procedió a los análisis del perfil de expresión de miRNAs. Primero se aisló de cada muestra el correspondiente RNA y se realizó transcripción reversa de RNA a cDNA usando el protocolo específico TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Posteriormente se utilizaron arrays TaqMan de baja densidad que permiten la cuantificación de 365 miRNAs humanos por PCR en tiempo 51
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